Безоперационное эндотрахеальном введении мышей с анализа легких и легочных Слив лимфатических узлов методом проточной цитометрии
Summary
Проиллюстрируем нехирургических доставки тестовых материалов в легких мышей под наркозом через трахею. Этот метод позволяет легкого воздействия бактериальных и вирусных патогенов, цитокины, антитела, бусы, химических веществ или красителей. Мы также описать уборки и обработки легких и легких дренаж лимфатических узлов (LDLNs) для проточной цитометрии.
Abstract
Фагоцитирующих клеток, таких как альвеолярные макрофаги и дендритные клетки легких (НРС) непрерывно образец антигенов из альвеолярного пространства в легких. НРС, в частности, как известно, мигрируют в легкие дренаж лимфатических узлов (LDLNs), где они представляют вдыхании антигенов Т-клеткам начать соответствующие иммунного ответа на различные иммуногенов 1,2. Для моделирования взаимодействия между легкими и воздушными антигены у мышей, антигены можно вводить интраназально 1,3,4, интратрахеально 5 или 6 в виде аэрозолей. Доставка каждый маршрут включает в себя различные технические навыки и ограничения, которые должны быть рассмотрены до проектирования эксперимента. Например, интраназального и аэрозольного воздействия антигенов обеспечивает как легких и верхних дыхательных путей. Следовательно антигенов можете получить доступ к носовой лимфоидной ткани (NALT) 7, потенциально осложняет интерпретацию результатов. Кроме того, глотание, чихание и дыхание скорость мыши также могут привести к противоречиям в дозах доставлено. Хотя участие верхних дыхательных путей может быть предпочтительным для некоторых исследований, она может усложнять эксперименты упором на события специально начата в легкие. В этих условиях интратрахеального (она) маршрут предпочтительнее, так как она обеспечивает испытания материалов непосредственно в легкие и обходит NALT. Многие ее протоколов инъекции потребовать либо слепое интубации трахеи через ротовую полость или хирургического воздействия трахеи для доступа легких. Здесь мы опишем простым, последовательным, нехирургических методов для него инстилляции. Открытие трахеи визуализируется использованием ларингоскопа и изогнутые иглы зонда затем вставляется непосредственно в трахею, чтобы доставить innoculum. Мы также описываем процедуры сбора и переработки LDLNs и легкие для анализа антиген торговли с помощью проточной цитометрии.
Protocol
Discussion
Мы использовали этот протокол для исследования торговли спор сибирской язвы Bacillus от легких к LDLNs. Для подобных приложений, число частиц, которые подаются в легкие должны быть тщательно выбраны так, что вводится материал может быть обнаружен в LDLNs с помощью проточной цитометрии. Мы ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 70μm Cell stariner | BD | ||
| Aniline Blue | Fisher | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper and Sons Inc | 7920 | |
| Collagenase | Sigma | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington | ||
| Collagenase D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | WelchAllyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd Laboratories |
References
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer’s-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
