تحت الجلد إدارة الخصوم والمسكارينية الثلاثي Immunostaining من إبهام العضلة الرافعة أوريس في الفئران
Summary
نحن تصف الإجراءات اللازمة لإدارة المتكررة من مثبطات المسكارينية يشير إلى الرافعة الأذن الطويلة (LAL) عضلات الفئران البالغين الشباب وimmunostaining لاحقة من التقاطعات في الاعصاب (NMJs) في wholemounts. عضلة LAL ومزايا فريدة للكشف عن<em> في الجسم الحي</em> التأثيرات الدوائية على NMJs.
Abstract
وكثيرا ما تستخدم عضلات الأطراف الخلفية من القوارض ، مثل الساق الأمامية والظنبوبي ، لفي الدراسات الدوائية المجراة من الإشارات الأساسية لتشكيل وصيانة NMJs الثدييات. ومع ذلك ، فإن تغلغل المخدرات في هذه العضلات بعد تحت الجلد أو في العضل الإدارة غالبا ما تكون ناقصة او غير مستوية وNMJs كثيرة يمكن أن تبقى غير متأثرة. على الرغم من أن الإدارة النظامية مع الأجهزة مثل المضخات الصغيرة يمكن أن تحسن من آثار spatiotemporal ، لا يمكن للطبيعة الغازية لهذا النهج يسبب التباس الاستجابات الالتهابية و / أو أضرار مباشرة في العضلات. وعلاوة على ذلك ، وتحليل كامل للNMJs في العضلة الخلفية أطرافهم يمثل تحديا لأنه يتطلب وقتا طويلا sectioning immunostaining المسلسل واسعة النطاق.
وLAL الماوس رقيقة ، ورقة مسطحة من العضلات الموجودة بشكل سطحي على ظهر الرقبة. فهو سريع نشل وظائف العضلات التي لتحريك الصيوان. أنه يحتوي على أجزاء منقاري والذيلية التي تنشأ من خط الوسط من الجمجمة ويمتد أفقيا إلى جزء غضروفي كل الصيوان. ويتم تزويد عضلة من قبل فرع من العصب الوجهي أن المشاريع caudally فور خروجها من الثقبة الإبرية الخشائية. لقد تم العثور على LAL وغيرها لتكون مريحة استعدادا التي توفر مزايا للتحقيق في المديين القصير والطويل الأجل في آثار المخدرات على الجسم الحي NMJs والعضلات. أولا ، وموقعها سطحية يسهل تطبيقات محلية متعددة من المخدرات تحت تخدير خفيف. الثانية ، لركاكة (2-3 طبقات من ألياف العضلات) تصاريح التصور والتحليل لNMJs كلها تقريبا داخل العضلات. ثالثا ، سهولة مع تشريح الأعصاب سليمة لها جنبا إلى جنب مع نمط تعصيب لها تصاريح التحليل التكميلي في المختبر 9،5 الكهربية. الماضي ، وربما الأهم من ذلك ، حجم صغير تطبيق (~ 50μl) تغطي بسهولة على سطح العضلة بأكملها ، ويوفر موحدة والتعرض المطول للNMJs به جميعا في المخدرات ويلغي الحاجة إلى اتباع نهج متسق 1،8.
Protocol
Discussion
الطريقة المعروضة هنا تصاريح التحقيق في أدوار غير المعترف بها في وقت سابق من mAChR – سلالة معينة يشير في الاستقرار وصيانة NMJs الثدييات. وسوف يكون هذا الأسلوب مفيدا أيضا لاختبار تأثير عوامل عصبية وكلاء الدوائية. على سبيل المثال ، وجدت أن لدينا مختبر الهدبية عامل التغذية ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة العضلات الضمور ، ورابطة (NS062320).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
