Administration sous-cutanée des antagonistes muscariniques et Triple-Immunocoloration du muscle releveur Longus Auris chez la souris
Summary
Nous décrivons les procédures de l'administration répétée d'inhibiteurs de la signalisation muscariniques à l'longus releveur Auris (LAL) de muscle de souris adultes jeunes et d'immunomarquage ultérieure de ses jonctions neuromusculaires (NMJs) dans des échantillons entiers. Le muscle a des avantages uniques du labo pour révéler<em> In vivo</em> Effets pharmacologiques sur NMJs.
Abstract
Muscles des membres postérieurs des rongeurs, comme les gastrocnémiens et du jambier antérieur, sont fréquemment utilisés pour les études pharmacologiques in vivo des signaux essentiels pour la formation et la maintenance de NMJs mammifères. Cependant, la pénétration du médicament dans ces muscles sous-cutanée ou intramusculaire est souvent incomplète ou inégale et de nombreuses NMJs peut rester inchangée. Bien que l'administration systémique de dispositifs tels que des mini-pompes peuvent améliorer les effets spatio-temporelle, le caractère invasif de cette approche peut entraîner de confusion réponses inflammatoires et / ou des dommages musculaires directes. Par ailleurs, l'analyse complète de la NMJs dans un muscle du membre postérieur est difficile car elle nécessite beaucoup de temps coupes sériées et immunomarquage vaste.
Le labo de la souris est une fine feuille plate de muscle situé superficiellement sur le dos de la nuque. C'est un tic musculaire rapide que les fonctions pour déplacer le pavillon de l'oreille. Il contient des portions rostrales et caudales qui proviennent de la ligne médiane du crâne et s'étendent latéralement à la partie cartilagineuse de chaque penne. Le muscle est innervé par une branche du nerf facial que les projets caudalement à sa sortie du trou stylo-mastoïdien. Nous et d'autres ont trouvé du labo pour être une préparation pratique qui offre des avantages pour l'enquête des deux courts et à long terme les effets in vivo de médicaments sur NMJs et les muscles. Tout d'abord, sa localisation superficielle facilite multiples applications locale de médicaments sous anesthésie légère. Deuxièmement, sa minceur (2-3 couches de fibres musculaires) permet la visualisation et l'analyse de presque tous les NMJs dans le muscle. Troisièmement, la facilité de le disséquer avec ses nerfs intacts avec le modèle de son innervation permet une analyse supplémentaire électrophysiologiques in vitro de 9,5. Enfin, et surtout, un petit volume appliqué (~ 50 pl) couvre facilement la surface du muscle entier, offre une exposition uniforme et prolongée de tous ses NMJs à la drogue et élimine la nécessité d'une approche systémique 1,8.
Protocol
Discussion
La méthode présentée ici permet d'établir le rôle précédemment non reconnu de sous-type de signalisation mAChR dans la stabilité et le maintien de NMJs mammifères. Cette méthode sera également utile pour tester les effets de facteurs neurotrophiques et des agents pharmacologiques. Par exemple, notre laboratoire a révélé que le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF), a suscité la germination de presque tous les terminaisons nerveuses LAL chez la souris adulte 1 . Ce résultat contraste avec les …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Muscular Dystrophy Association, le NIH (NS062320).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
