A administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e Triple-A imunocoloração do músculo Longus Levator Auris em Ratos
Summary
Descrevemos os procedimentos para a administração repetida de inibidores da sinalização muscarínicos ao longus levantador auris (LAL) muscular de ratos adultos jovens e para a imunocoloração subseqüente de sua junções neuromusculares (NMJs) em wholemounts. O músculo LAL tem vantagens exclusivas para revelar<em> In vivo</em> Efeitos farmacológicos NMJs.
Abstract
Músculos dos membros posteriores de roedores, como o gastrocnêmio e tibial anterior, são freqüentemente usados para estudos farmacológicos in vivo dos sinais essenciais para a formação e manutenção de NMJs mamíferos. No entanto, a penetração de drogas para esses músculos após subcutânea ou intramuscular é muitas vezes incompleta ou irregular e NMJs muitos podem permanecer inalteradas. Embora a administração sistêmica com dispositivos como mini-bombas podem melhorar os efeitos espaço-temporais, a natureza invasiva deste método pode causar confusão respostas inflamatórias e / ou lesão muscular direta. Além disso, a análise completa do NMJs em um músculo dos membros posteriores é desafiador porque requer demorado seccionamento serial e imunocoloração extensiva.
A LAL mouse é uma folha, fino e liso do músculo localizado superficialmente no dorso do pescoço. É um músculo de contração rápida, que funciona para mover o pavilhão auricular. Ele contém porções rostral e caudal que se originam a partir da linha média do crânio e se estendem lateralmente à porção cartilaginosa de cada pavilhão. O músculo é fornecida por um ramo do nervo facial que os projetos caudalmente à medida que sai do forame stylomastoid. Nós e os outros descobriram LAL ser uma preparação conveniente que oferece vantagens para a investigação de curto e longo prazo os efeitos in vivo de drogas em NMJs e músculos. Em primeiro lugar, a sua localização superficial facilita múltiplas aplicações locais de medicamentos sob anestesia luz. Segundo, sua magreza (2-3 camadas de fibras musculares) permite a visualização e análise de quase todos os NMJs dentro do músculo. Em terceiro lugar, a facilidade de dissecando-a com a sua intacta nervo, juntamente com o padrão de sua inervação permite análise suplementar eletrofisiológicos in vitro 9,5. Por último, e talvez mais importante, um pequeno volume aplicado (~ 50μl) facilmente cobre a superfície do músculo inteiro, fornece uma exposição uniforme e prolongado de todos os seus NMJs à droga e elimina a necessidade de uma abordagem sistêmica 1,8.
Protocol
Discussion
O método aqui apresentado permite a investigação de papéis previamente não reconhecido do subtipo específico mAChR sinalização na estabilidade e manutenção de NMJs mamíferos. Este método será útil também para testar os efeitos de fatores neurotróficos e agentes farmacológicos. Por exemplo, nosso laboratório constatou que fator neurotrófico ciliar (CNTF) provocou surgimento de quase todos os terminais nervosos LAL em ratos adultos 1 . Este resultado contrasta com estudos anteriores de CNTF trata…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Muscular Dystrophy Association, NIH (NS062320).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
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