We beschrijven de procedures voor de herhaalde toediening van remmers van muscarine-signalering naar de levator Auris longus (LAL) spier van jong volwassen muizen en voor de daaropvolgende immunokleuring van de neuromusculaire verbindingen (NMJs) in wholemounts. De LAL spier heeft unieke voordelen voor het openbaren van<em> In vivo</em> Farmacologische effecten op de NMJs.
Achterste ledematen spieren van knaagdieren, zoals de gastrocnemius en de m. tibialis anterior, worden vaak gebruikt voor in vivo farmacologische studies van de signalen essentieel voor de vorming en instandhouding van zoogdieren NMJs. Echter, drugs penetratie in deze spieren na subcutane of intramusculaire toediening is vaak onvolledig of oneffen en vele NMJs kunnen blijven onaangetast. Hoewel de systemische toediening met apparaten zoals mini-pompen kunnen het verbeteren van de spatiotemporele effecten, kan het invasieve karakter van deze aanpak leiden tot verwarrende ontstekingsreacties en / of directe spierschade. Bovendien is het volledige analyse van de NMJs in een achterste ledematen spier een uitdaging, want het vereist tijdrovende serie snijden en uitgebreide immunokleuring.
De muis LAL is een dunne, vlakke plaat van de spieren oppervlakkig gelegen op het dorsale gedeelte van de nek. Het is een fast-twitch spier die functies te bewegen de oorschelp. Het bevat rostrale en caudale delen die afkomstig zijn van de middellijn van de schedel en uit te breiden zijdelings aan de kraakbenige gedeelte van elk oorschelp. De spier wordt geleverd door een tak van de nervus facialis die caudaal projecten dat uit de stylomastoid foramen. Wij en anderen hebben gevonden LAL naar een geschikte preparaat dat voordelen voor het onderzoek van zowel korte als lange termijn in vivo effecten van drugs op NMJs en spieren aanbiedingen zijn. De eerste, de oppervlakkige ligging maakt meerdere lokale toepassingen van drugs onder lichte narcose. Ten tweede, de dunheid (2-3 lagen van spiervezels) staat visualisatie en analyse van bijna alle NMJs binnen de spier. Ten derde, het gemak van ontleden met zijn zenuw intact, samen met het patroon van de innervatie vergunningen aanvullende elektrofysiologische analyse in vitro 9,5. Laatste, en misschien wel het allerbelangrijkste, een klein toegepaste volume (~ 50μl) dekt met gemak de hele spier oppervlak, zorgt voor een uniforme en langdurige blootstelling van al haar NMJs om het geneesmiddel en elimineert de noodzaak voor een systemische benadering 1,8.
De methode maakt hier gepresenteerde onderzoek van niet eerder opgenomen rollen van subtype-specifieke mAChR signalering in de stabiliteit en het onderhoud van zoogdieren NMJs. Deze methode zal ook nuttig zijn om de effecten van neurotrofe factoren en farmacologische stoffen te testen. Bijvoorbeeld: ons laboratorium bleek dat ciliaire neurotrofe Factor (CNTF) veroorzaakte ontspruit uit bijna alle LAL zenuwuiteinden in volwassen muizen 1 . Dit resultaat in contrast met eerdere studies van CNTF behandelde achterste…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door Vereniging voor Musculaire Dystrofie, NIH (NS062320).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |