Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse
Summary
Wir beschreiben Verfahren für die wiederholte Gabe von Inhibitoren der Muskarin-Signalisierung an die levator auris longus (LAL) Muskel junger erwachsener Mäuse und für die anschließende Immunfärbung der neuromuskulären Synapsen (NMJs) in wholemounts. Der LAL-Muskel hat einzigartige Vorteile für die Entdeckung<em> In vivo</em> Pharmakologische Wirkungen auf NMJs.
Abstract
Hinterbein Muskeln von Nagetieren, wie gastrocnemius und tibialis anterior, werden häufig für in vivo pharmakologische Studien der Signale für die Bildung und Pflege von Säugetieren NMJs verwendet. Allerdings ist eine medikamentöse Eindringen in diese Muskeln nach subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung häufig unvollständig oder ungleichmäßig und viele NMJs können, bleiben unberührt. Obwohl die systemische Verabreichung von Geräten wie Mini-Pumpen der raum-zeitlichen Wirkungen verbessern kann, kann die invasive Natur dieses Ansatzes Ursache zu verwechseln entzündliche Reaktionen und / oder direkte Schädigung der Muskulatur. Darüber hinaus ist eine vollständige Analyse der NMJs in einem Hinterbein Muskeln schwierig, weil es zeitaufwendig serielle Schnitte und umfangreiche Immunfärbung erfordert.
Die Maus LAL ist ein dünnes, flaches Blatt Muskel oberflächlich auf dem Rücken des Halses befindet. Es ist eine schnell zuckenden, dass die Funktionen auf der Ohrmuschel zu bewegen. Es enthält rostralen und kaudalen Abschnitte, die von der Mittellinie des Schädels stammen und erstrecken sich seitlich auf die knorpeligen Teil jeder Ohrmuschel. Der Muskel wird durch einen Zweig des Nervus facialis, die kaudal Projekte beim Verlassen des Foramen stylomastoideum geliefert. Wir und andere haben herausgefunden, LAL, um eine bequeme Zubereitung, die Vorteile für die Untersuchung von kurz-und langfristigen In-vivo-Wirkungen von Drogen auf NMJs und Muskeln bietet. Erstens erleichtert ihre oberflächliche Lage mehrere lokale Applikationen von Medikamenten unter leichter Betäubung. Zweitens ermöglicht seine Dünnheit (2-3 Schichten von Muskelfasern) Visualisierung und Analyse von fast allen NMJs innerhalb des Muskels. Drittens erlaubt die einfache seziert er mit seinen Nerven intakt zusammen mit dem Muster seiner Innervation ergänzende elektrophysiologische Untersuchungen in vitro 9,5. Last, und vielleicht am wichtigsten, eine kleine applizierte Volumen (~ 50 ul) leicht deckt den gesamten Muskel-Oberfläche sorgt für eine gleichmäßige und bei längerer Exposition aller NMJs auf das Medikament und eliminiert die Notwendigkeit für einen systemischen Ansatz 1,8.
Protocol
Discussion
Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Untersuchung von bisher nicht Rollen von Subtyp-spezifischen mAChR Signalisierung in die Stabilität und die Wartung von Säugetieren NMJs. Diese Methode wird auch nützlich sein, um die Auswirkungen von neurotrophen Faktoren und pharmakologische Wirkstoffe zu testen. Zum Beispiel fand unser Labor, dass Ciliary neurotrophen Faktor (CNTF) sprießen aus nahezu allen LAL Nervenendigungen in erwachsenen Mäusen hervorgerufen 1 . Dieses Ergebnis mit früheren Studien von C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Muscular Dystrophy Association, NIH (NS062320) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
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