Purification de Hsp104, une protéine Disaggregase

Summary

Ici, nous décrivons un protocole pour la purification de la très active Hsp104, un AAA + hexamérique protéines de la levure, qui couple l'hydrolyse d'ATP à la désagrégation des protéines. Ce schéma exploite une construction His6-marqués pour la purification d'affinité à partir<em> E. coli</em> Suivie par chromatographie échangeuse d'anions, His6-tag retrait avec la protéase TEV, et chromatographie d'exclusion stérique.

Abstract

Hsp104 est un hexamère AAA + ¹ à partir de protéines de la levure, qui couple l'hydrolyse d'ATP à la protéine de désagrégation ^2-10 (Fig. 1). Cette activité confère deux grands avantages sélectifs. Tout d'abord, la renaturation des agrégats désordonnés par Hsp104 permet la survie de la levure après diverses protéines-repliement souligne, notamment ^3,5,11,12 choc thermique. Deuxièmement, le remodelage des fibrilles amyloïdes bêta par la Croix-Hsp104 permet d'exploiter la levure prions myriades (amyloïdes infectieux) comme un réservoir de bénéfique et héritable variation phénotypique ^13-22. Remarquablement, Hsp104 remodèle directement oligomères preamyloid et fibrilles amyloïdes, y compris ceux comprenant des protéines prion de levure et de SUP35 URE2 ^23-30. Cette fonctionnalité amyloïde remodelage est une facette spécialisée de la levure Hsp104. Le E. orthologue coli, CLPB, ne parvient pas à transformer ou oligomères preamyloid fibrilles amyloïdes ^26,31,32.

Orthologues Hsp104 se trouvent dans tous les règnes de la vie, sauf, perplexingly, les animaux. En effet, si les cellules animales possèdent aucun système enzymatique que la désagrégation de protéines aux couples de renaturation (plutôt que de la dégradation) demeure inconnue ^33-35. Ainsi, nous et d'autres ont proposé que Hsp104 pourrait être développé comme un agent thérapeutique pour diverses maladies neurodégénératives liées au mauvais repliement de protéines spécifiques dans les oligomères preamyloid toxiques et fibrilles amyloïdes ^{4,7,23,36-38.} Il n'y a pas de traitements qui ciblent directement les espèces agrégées associées à ces maladies. Pourtant, Hsp104 dissout oligomères toxiques et fibrilles amyloïdes composé d'alpha-synucléine, qui sont liés à la maladie de Parkinson ²³ ainsi que les formes de PrP amyloïde ^39. Surtout, Hsp104 réduit l'agrégation des protéines et améliore la neurodégénérescence dans des modèles rongeurs de la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington ^{23 38.} Idéalement, pour optimiser le traitement et de minimiser les effets secondaires, Hsp104 serait conçu et potentialisé de façon sélective remodeler agrégats spécifiques au centre de la maladie en question ^4,7. Cependant, la compréhension limitée structurelles et mécanistiques sur la manière dont Hsp104 désagrège un tel répertoire varié de structures agrégées et les protéines non liées frustre ces efforts ^30,40-42.

Pour comprendre la structure et le mécanisme de Hsp104, il est essentiel d'étudier la protéine pure et reconstituer son activité disaggregase avec des composants minimes. Hsp104 est une protéine 102kDa avec un pI de 5,3 ~, qui hexamerizes, en présence de l'ADP ou l'ATP, ou à des concentrations élevées de protéines en l'absence de ^43-46 nucléotides. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour la purification de très actif, stable Hsp104 de E. coli. L'utilisation de E. coli permet simplifiée production à grande échelle et à notre méthode peut être effectuée rapidement et de manière fiable pour de nombreuses variantes Hsp104. Notre protocole augmente Hsp104 pureté et simplifie son _6-tag retrait par rapport à un procédé de purification préalable de E. coli ^47. Par ailleurs, notre protocole est plus facile et pratique de deux protocoles les plus récents ^26,48.

Protocol

1. Expression de Hsp104 Le plasmide utilisé pour la purification dans E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, contient les Hsp104 ouvert cadre de lecture sous le contrôle du promoteur inductible TRC 26. Le plasmide produit Hsp104 avec un N-terminale Sa 6-tag qui peut être enlevée par clivage de la protéase TEV. Transformez pPROEX-HTB-Hsp104 en codon optimisé E. coli BL21-CodonPlus-RIL cellules (Stratagene, Agilent Technologies) en utilisant une procédure de transfor…

Discussion

Chronologie: Pour Hsp104 activité maximale, nous recommandons que le schéma de purification entière soit achevée aussi rapidement que possible. Cependant, le nombre d'étapes de purification rend un horaire exigeant qui ne peuvent pas toujours être pratique. Si les étapes de purification sont effectués aussi rapidement que possible, le temps de la fin de l'expression du jour au lendemain grâce à l'2-4 heures d'incubation à 30 ° C avec TEV protéase est d'environ 9-11 heures. Un lieu…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells	Stratagene, Agilent Technologies	230255
2XYT broth	USB	75864
Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets	Roche	1836170
Pepstatin A	Sigma	P4265
Ni-Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-5318-02
Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000)	Millipore	UFC903008
Resource Q – 6ml column	GE Healthcare	17-1179-01
proTEV Protease	Promega	V6052
AcTEV Protease	Invitrogen	12575015
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
Hsp40	Assay Designs	SPP-400
Hsp72	Assay Designs	ADI-NSP-555