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Biology

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

Published: September 30, 2011
doi:
10.3791/3190
, ,
1Department of Biochemistry and Biophysics,University of Pennsylvania

Summary

ここで、我々は、高活性Hsp104、六量体AAA +タンパク質酵母、タンパク質の分解に結合ATPの加水分解からの精製のためのプロトコルについて説明します。このスキームでは、からアフィニティー精製のためのしたHis6 -タグ付き構造を活用して<em> E.大腸菌</em> TEVプロテアーゼとアニオン交換クロマトグラフィー、His 6 – タグの削除、およびサイズ​​排除クロマトグラフィー。

Abstract

Hsp104は酵母から六量AAA +タンパク質1、タンパク質分解2-10の結合ATPの加水分解（図1）です。この活動は2つの重要な選択的な利点を与える。最初に、Hsp104による無秩序な集合体の再生は、熱ショック3,5,11,12を含む、様々なタンパク質折り畳みのストレスの後に酵母の生存を支援します。第二に、Hsp104によるクロスβアミロイド線維の改造は、有益なの貯水池として無数のプリオン（感染性アミロイド）を悪用し、13から22まで表現型変異を遺伝する酵母を可能にします。驚くべきことに、Hsp104は直接酵母のプリオンタンパク質Sup35由来とUre2 23から30で構成されるものを含むpreamyloidのオリゴマーおよびアミロイド線維を、remodels。このアミロイド-リモデリング機能は、酵母Hsp104の特殊な一面です。 E.大腸菌オルソログ、ClpBは、改造のpreamyloidのオリゴマーまたはアミロイド線維26,31,32に失敗します。

Hsp104のオルソログは、動物、perplexingly、除く生命のすべての国で発見されています。確かに、動物細胞は、任意の酵素システムを持っているかどうかを再生（むしろ劣化より）に結合する蛋白質の分解は、未知の33から35のままという。従って、我々と他のHsp104は毒性preamyloidのオリゴマーおよびアミロイド線維4,7,23,36-38に特定のタンパク質の折り畳みと接続されているさまざまな神経変性疾患の治療薬として開発される可能性がありますことを提案した。直接これらの疾患に関連する集約された種を対象にない治療法はありません。まだ、Hsp104はパーキンソン病23と同様にPrPの39のアミロイドの形態で接続されているα-シヌクレイン、から構成される毒性オリゴマーとアミロイド線維を溶解する。重要なのは、Hsp104は、タンパク質の凝集を低減し、パーキンソン病23ハンチントン病38の齧歯類モデルでの神経変性を改善する。理想的には、治療を最適化し、副作用を最小限に抑えるために、Hsp104は選択問題4,7の疾患に中心的な特定の集合体を改造するように設計し、増強される。しかし、どのようにHsp104 disaggregatesの限られた構造とメカニズムの理解が集約された構造と無関係な蛋白質のそのような多様なレパートリーは、これらの努力の30,40-42をいらだた。

Hsp104の構造とメカニズムを理解するには、最小限のコンポーネントを使用して、純粋な蛋白質と再構成するそのdisaggregaseの活動を研究することが不可欠である。 Hsp104は、ADPまたはATPの存在下で、またはヌクレオチド43から46の非存在下での高タンパク質濃度でhexamerizes〜5.3のpIを持つ102kDa蛋白質である。ここでは、Eからの高活性、安定Hsp104の精製に最適化されたプロトコルを記述する大腸菌 。 E.の使用大腸菌は、簡略化された大規模な生産を可能にし、私たちの手法は、多数のHsp104バリアントのために迅速かつ確実に行うことができます。我々のプロトコルは、Hsp104純度を向上させ、Eからの以前の精製法に比べて彼の6タグの除去を簡素化大腸菌 47。また、我々のプロトコルは2つのより最近のプロトコル26,48よりも容易な、便利です。

Protocol

1。 Hsp104の発現プラスミドは、E.の精製に用いる大腸菌 、pPROEX – HTB – Hsp104は、trcプロモーター26の誘導制御下Hsp104オープンリーディングフレームが含まれています。プラスミドは、TEVプロテアーゼ切断により除去することができるN -末端His 6 – tagをHsp104を生成します。コドン最適化E.にpPROEX – HTB – Hsp104を変換典型的な細菌の形質転換法を用い?…

Discussion

タイムライン：最大Hsp104の活動は私達が全体の精製スキームが可能な限り迅速に完了することをお勧めします。しかし、精製ステップの数は、必ずしも実用的ではないかもしれない厳しいスケジュールになります。精製工程は30℃インキュベーションの2-4時間まで、できるだけ早く一晩式の終わりから時間を実施している場合° TEVプロテアーゼとCは、約9〜11時間です。一時停止のひと?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIH（5T32GM008275 – 22）とアメリカ心臓協会博士号を取得する前のフェローシップ（EASまで）からの助成金によって支えられて、化学、生物学のインターフェイスのNIH（2T32GM071339 – 06A1）（MEDまで）からフェローシップ、およびからの補助金NIH（1DP2OD002177 – 01とNS067354 – 0110）、エリソン医学財団、ビル＆メリンダゲイツ財団（JSまで）。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells Stratagene, Agilent Technologies 230255
2XYT broth USB 75864
Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets Roche 1836170
Pepstatin A Sigma P4265
Ni-Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare 17-5318-02
Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) Millipore UFC903008
Resource Q – 6ml column GE Healthcare 17-1179-01
proTEV Protease Promega V6052
AcTEV Protease Invitrogen 12575015
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Hsp40 Assay Designs SPP-400
Hsp72 Assay Designs ADI-NSP-555
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PurificationHsp104Protein DisaggregaseHexameric AAA+ ProteinATP HydrolysisProtein DisaggregationRenaturationDisordered AggregatesHeat ShockCross-beta Amyloid FibrilsPrionsPhenotypic VariationPreamyloid OligomersE. Coli Orthologue ClpBHsp104 OrthologuesAnimal CellsTherapeutic AgentNeurodegenerative DiseasesMisfolding Of ProteinsToxic Preamyloid OligomersAmyloid Fibrils
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Sweeny, E. A., DeSantis, M. E., Shorter, J. Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase. J. Vis. Exp. (55), e3190, doi:10.3791/3190 (2011).
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