ここで、我々は、高活性Hsp104、六量体AAA +タンパク質酵母、タンパク質の分解に結合ATPの加水分解からの精製のためのプロトコルについて説明します。このスキームでは、からアフィニティー精製のためのしたHis6 -タグ付き構造を活用して E.大腸菌 TEVプロテアーゼとアニオン交換クロマトグラフィー、His 6 - タグの削除、およびサイズ排除クロマトグラフィー。
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この記事について
サマリー
要約
Hsp104は酵母から六量AAA +タンパク質1、タンパク質分解2-10の結合ATPの加水分解（図1）です。この活動は2つの重要な選択的な利点を与える。最初に、Hsp104による無秩序な集合体の再生は、熱ショック3,5,11,12を含む、様々なタンパク質折り畳みのストレスの後に酵母の生存を支援します。第二に、Hsp104によるクロスβアミロイド線維の改造は、有益なの貯水池として無数のプリオン（感染性アミロイド）を悪用し、13から22まで表現型変異を遺伝する酵母を可能にします。驚くべきことに、Hsp104は直接酵母のプリオンタンパク質Sup35由来とUre2 23から30で構成されるものを含むpreamyloidのオリゴマーおよびアミロイド線維を、remodels。このアミロイド-リモデリング機能は、酵母Hsp104の特殊な一面です。 E.大腸菌オルソログ、ClpBは、改造のpreamyloidのオリゴマーまたはアミロイド線維26,31,32に失敗します。
Hsp104のオルソログは、動物、perplexingly、除く生命のすべての国で発見されています。確かに、動物細胞は、任意の酵素システムを持っているかどうかを再生（むしろ劣化より）に結合する蛋白質の分解は、未知の33から35のままという。従って、我々と他のHsp104は毒性preamyloidのオリゴマーおよびアミロイド線維4,7,23,36-38に特定のタンパク質の折り畳みと接続されているさまざまな神経変性疾患の治療薬として開発される可能性がありますことを提案した。直接これらの疾患に関連する集約された種を対象にない治療法はありません。まだ、Hsp104はパーキンソン病23と同様にPrPの39のアミロイドの形態で接続されているα-シヌクレイン、から構成される毒性オリゴマーとアミロイド線維を溶解する。重要なのは、Hsp104は、タンパク質の凝集を低減し、パーキンソン病23ハンチントン病38の齧歯類モデルでの神経変性を改善する。理想的には、治療を最適化し、副作用を最小限に抑えるために、Hsp104は選択問題4,7の疾患に中心的な特定の集合体を改造するように設計し、増強される。しかし、どのようにHsp104 disaggregatesの限られた構造とメカニズムの理解が集約された構造と無関係な蛋白質のそのような多様なレパートリーは、これらの努力の30,40-42をいらだた。
Hsp104の構造とメカニズムを理解するには、最小限のコンポーネントを使用して、純粋な蛋白質と再構成するそのdisaggregaseの活動を研究することが不可欠である。 Hsp104は、ADPまたはATPの存在下で、またはヌクレオチド43から46の非存在下での高タンパク質濃度でhexamerizes〜5.3のpIを持つ102kDa蛋白質である。ここでは、Eからの高活性、安定Hsp104の精製に最適化されたプロトコルを記述する大腸菌 。 E.の使用大腸菌は、簡略化された大規模な生産を可能にし、私たちの手法は、多数のHsp104バリアントのために迅速かつ確実に行うことができます。我々のプロトコルは、Hsp104純度を向上させ、Eからの以前の精製法に比べて彼の6タグの除去を簡素化大腸菌 47。また、我々のプロトコルは2つのより最近のプロトコル26,48よりも容易な、便利です。
プロトコル
1。 Hsp104の発現
- プラスミドは、E.の精製に用いる大腸菌 、pPROEX - HTB - Hsp104は、trcプロモーター26の誘導制御下Hsp104オープンリーディングフレームが含まれています。プラスミドは、TEVプロテアーゼ切断により除去することができるN -末端His 6 - tagをHsp104を生成します。コドン最適化E.にpPROEX - HTB - Hsp104を変換典型的な細菌の形質転換法を用いて大腸菌は BL21 - CodonPlus - RIL細胞（Stratagene、アジレントテクノロジー）（例：製造業者の指示に従って）。コドン最適化E.を使用することが重要です。 Hsp104は珍しいコドンバイアスを持っているので、 大腸菌の菌株。
- 100mLの2XYT文化（USB.レシピさ：16g / Lカゼインペプトン、10gの/ L酵母エキス、5グラム/ LのNaCl、pH 7.0）に植菌、新鮮な形質で100μg/mLアンピシリン及び34μg/mLクロラムフェニコールを添加したが、37で一晩成長° 200rpmで振盪しながらC。
- 2Lフラスコに100μg/mLアンピシリン及び34μg/mLクロラムフェニコールで6 × 1L 2XYTに一晩培養液10mLを接種する。 37 ° Cま....
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ディスカッション
タイムライン：最大Hsp104の活動は私達が全体の精製スキームが可能な限り迅速に完了することをお勧めします。しかし、精製ステップの数は、必ずしも実用的ではないかもしれない厳しいスケジュールになります。精製工程は30℃インキュベーションの2-4時間まで、できるだけ早く一晩式の終わりから時間を実施している場合° TEVプロテアーゼとCは、約9〜11時間です。一時停止のひとつの潜在的な場所は、TEV切断ステップに従っています。どうしても必要な場合は、Hsp104は、上述のようにこのステップの後、フリーズしてスナップ（ステップ5.2）があります。サイズ排除クロマトグラフィー（ステップ3.9）次に、解凍後すぐに実行され、精製Hsp104は、生化学的アッセイのために直ちに使用する必要があります。これは全体的な収率を減少させるが、さらに誘導のステップはまた、37℃で2時間Cに合理化することができます。
潜在的な合併症：この精製スキームは単純です。しかし、いくつかの重要なステップと代替手順を以下に説明されています。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、NIH（5T32GM008275 - 22）とアメリカ心臓協会博士号を取得する前のフェローシップ（EASまで）からの助成金によって支えられて、化学、生物学のインターフェイスのNIH（2T32GM071339 - 06A1）（MEDまで）からフェローシップ、およびからの補助金NIH（1DP2OD002177 - 01とNS067354 - 0110）、エリソン医学財団、ビル＆メリンダゲイツ財団（JSまで）。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | |
| BL21 - CodonPlus - RILコンピテントセル | ストラタジーン社、アジレントテクノロジー | 230255 | |
| 2XYTスープ | USB | 75864 | |
| 完全な、ミニ、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤の錠剤 | ロッシュ | 1836170 | |
| ペプスタチン | シグマ | P4265 | |
| NI -セファロース6 Fast Flowは | GEヘルスケア | 17-5318-02 | |
| アミコンウルトラ- 15遠心フィルターユニット（分画分子量30,000） | ミリポア | UFC903008 | |
| 資源Q - 6ミリリットル列 | GEヘルスケア | 17-1179-01 | |
| proTEVプロテアーゼ | プロメガ | V6052 | |
| AcTEVプロテアーゼ | インビトロジェン | 12575015 | |
| スーパーローズ6 300分の10 GL | GEヘルスケア | 17-5172-01 | |
| HSP40 | アッセイデザイン | SPP - 400 | |
| Hsp72 | アッセイデザイン | ADI - NSP - 555 |
参考文献
- Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System th....
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再版と許可
