Aqui, nós descrevemos um protocolo para a purificação de altamente ativa Hsp104, a AAA hexamérica + proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP a desagregação de proteína. Este esquema explora uma construção His6 marcadas para a purificação de afinidade<em> E. coli</em> Seguido de cromatografia de troca aniônica, His6 tag-remoção com protease TEV e tamanho-exclusão cromatografia.
Hsp104 é um hexamérica AAA + 1 proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP para a proteína desagregação 10/02 (Fig. 1). Esta atividade dá dois principais vantagens seletivas. Primeiro, renaturalização de agregados desordenada por Hsp104 capacita sobrevivência levedura após várias proteínas-misfolding salienta, incluindo choque térmico 3,5,11,12. Em segundo lugar, a remodelação das fibrilas de cross-beta-amilóide por Hsp104 permite levedura para explorar prions miríade (amilóides infecciosas) como um reservatório de benéfico e hereditárias variação fenotípica 13-22. Notavelmente, Hsp104 diretamente remodela oligômeros preamyloid e fibrilas amilóides, incluindo aqueles composto de proteínas de levedura prion Sup35 e Ure2 23-30. Esta funcionalidade amilóide remodelação é uma faceta especializados de levedura Hsp104. O E. orthologue coli, ClpB, não oligômeros remodelar preamyloid ou fibrilas amilóides 26,31,32.
Orthologues Hsp104 são encontrados em todos os reinos da vida, exceto, perplexidade, os animais. De fato, se as células animais possuem qualquer sistema enzimático que os casais desagregação proteína para renaturalização (ao invés de degradação) permanece desconhecido 33-35. Assim, nós e outros propuseram que Hsp104 pode ser desenvolvido como um agente terapêutico para várias doenças neurodegenerativas relacionadas com o misfolding de proteínas específicas em oligômeros preamyloid tóxicos e fibrilas amilóides 4,7,23,36-38. Não existem tratamentos que visam directamente as espécies agregados associados a estas doenças. No entanto, se dissolve Hsp104 oligômeros tóxicos e fibrilas amilóides composto de alfa-sinucleína, que são conectados com Doença de Parkinson 23, bem como formas de amilóide de PrP 39. Importante, Hsp104 reduz a agregação da proteína e melhora a neurodegeneração em modelos de roedores da doença de Parkinson 23 e doença de Huntington 38. Idealmente, para otimizar o tratamento e minimizar os efeitos colaterais, Hsp104 seria projetado e potencializadas para seletivamente remodelar agregados específicos central para a doença em questão 4,7. No entanto, a limitada compreensão estrutural e mecânica de como Hsp104 desagrega um repertório tão diversificado de estruturas agregadas e proteínas não relacionadas frustra estes esforços 30,40-42.
Para compreender a estrutura e mecanismo de Hsp104, é essencial para estudar a proteína pura e reconstituir a sua actividade disaggregase com componentes mínimos. Hsp104 é uma proteína 102kDa com um pI de aproximadamente 5,3, que hexamerizes na presença de ADP ou ATP, ou em concentrações da proteína na ausência de 43-46 nucleotídeos. Aqui, nós descrevemos um protocolo otimizado para a purificação de altamente ativa, Hsp104 estável de E. coli. O uso de E. coli simplificado permite produção em larga escala e nosso método pode ser realizado de forma rápida e confiável para inúmeras Hsp104 variantes. Nosso protocolo aumenta Hsp104 pureza e simplifica a sua remoção 6 tag em comparação com um método de purificação prévia do E. coli 47. Além disso, o nosso protocolo é mais fácil e conveniente do que dois protocolos mais recentes 26,48.
Cronograma: Para a atividade Hsp104 máxima recomendamos que o sistema de purificação de todo ser concluída o mais rapidamente possível. No entanto, o número de etapas de purificação torna um calendário exigente, que nem sempre pode ser prático. Se as etapas de purificação são realizadas o mais rapidamente possível, o tempo a partir do final de expressão durante a noite até a 2-4 horas de incubação a 30 ° C com TEV protease é de aproximadamente 9-11 horas. Um lugar potencial para fazer uma paus…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por uma concessão do NIH (5T32GM008275-22) e um American Heart Association predoctoral comunhão (para EAS); uma bolsa de interface Química Biologia a partir do NIH (2T32GM071339-06A1) (para MED); e subvenções do NIH (1DP2OD002177-01 e NS067354-0110), The Ellison Medical Foundation e The Bill and Melinda Gates Foundation (a JS).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 |
2XYT broth | USB | 75864 |
Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 1836170 |
Pepstatin A | Sigma | P4265 |
Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 |
Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) | Millipore | UFC903008 |
Resource Q – 6ml column | GE Healthcare | 17-1179-01 |
proTEV Protease | Promega | V6052 |
AcTEV Protease | Invitrogen | 12575015 |
Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 |
Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |