Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase
Summary
Burada, son derece aktif Hsp104 hexameric AAA + protein mayası, protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi arıtma için bir protokol açıklar. Bu düzeni yakınlık arıtma için His6 etiketli inşa patlatır<em> E. coli</em> Anyon-değiştirici kromatografi, TEV proteaz His6-tag kaldırılması, ve boyut dışlama kromatografisi izledi.
Abstract
Hsp104 maya hexameric bir AAA + protein 1, 2-10 protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi (Şekil 1). Bu etkinlik iki anahtar seçici avantaj kazandırır. Birincisi, Hsp104 tarafından düzensiz agrega Yeniden doğallaştırmanın ısı şok 3,5,11,12 dahil olmak üzere, çeşitli protein misfolding gerilmeler sonra maya hayatta kalma güçlendirir. İkincisi, Hsp104 çapraz beta amiloid fibriller itilme, sayısız yarar sağlayan bir rezervuar olarak prion (enfeksiyöz amiloidleri) yararlanmak ve 13-22 fenotipik varyasyon kalıtsal maya sağlar . Enteresandır ki, Hsp104 doğrudan maya prion proteinlerin Sup35 ve Ure2 23-30 oluşan olanlar da dahil olmak üzere preamyloid oligomerler ve amiloid fibriller remodels. Bu amiloid remodeling işlevselliği maya Hsp104 özel bir yönüdür. E. coli orthologue, ClpB, yeni model preamyloid oligomerler veya amiloid fibriller 26,31,32 başarısız olur.
Hsp104 orthologues hayvanlar, perplexingly dışında yaşamın tüm krallıkları bulundu. Gerçekten de, hayvan hücrelerinde herhangi bir enzim sistemine sahip olmadığını Yeniden doğallaştırmanın (yerine bozulması daha) çiftler protein ayrıştırılmasıyla bilinmeyen 33-35 kalır . Bu nedenle, biz ve diğerleri Hsp104 toksik preamyloid oligomerler ve amiloid fibriller 4,7,23,36-38 spesifik proteinlerin misfolding bağlı çeşitli nörodejeneratif hastalıklar için tedavi edici bir ajan olarak gelişmiş olabilir önerdi. Bu hastalıklar ile ilişkili toplanan türlerin doğrudan hedef tedaviler vardır. Ancak, Hsp104, Parkinson Hastalığı 23 gibi PrP 39 amiloid formları ile bağlı alfa-sinüklein oluşan toksik oligomerler ve amiloid fibriller çözünür . Daha da önemlisi, Hsp104 protein agregasyonunu azaltır ve Parkinson Hastalığı 23 ve Huntington hastalığı 38 kemirgen modellerinde nörodejenerasyon düzelir. İdeal olarak, tedavi optimize etmek ve yan etkileri en aza indirmek için, Hsp104 mühendislik ve seçici soru 4,7 hastalığın merkezi özel agrega bozulmasina potansiyelize olacaktır . Ancak, nasıl Hsp104 disaggregates sınırlı yapısal ve mekanik bir anlayış toplanan yapıları ve ilgisiz proteinler gibi farklı bir repertuar bu çalışmaların 30,40-42 köstekliyor .
Hsp104 yapısı ve mekanizması anlamak için, saf protein ve sulandırmak, disaggregase aktivite minimal bileşenleri ile çalışmak için gerekli. Hsp104 ~ 5.3, ADP ve ATP varlığında veya yokluğunda 43-46 nükleotid yüksek protein konsantrasyonları hexamerizes pI 102kDa proteindir. Burada, son derece aktif, istikrarlı Hsp104 E. temizleme için optimize edilmiş bir protokol tarif coli. E. coli basitleştirilmiş büyük ölçekli üretim sağlar ve yöntemi çok sayıda Hsp104 varyantları için hızlı ve güvenilir bir şekilde yapılabilir. Bizim protokol Hsp104 saflığı artar ve E. önceki bir arıtma yöntemi ile karşılaştırıldığında, O'nun 6-tag çıkarma işlemlerini basitleştiriyor coli, 47. Ayrıca, bizim protokol iki daha yeni protokoller 26,48 daha bayağı ve rahat.
Protocol
Discussion
Zaman Çizelgesi: maksimum Hsp104 aktivite için tüm arıtma düzeni mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tamamlanmış olması tavsiye edilir . Ancak, arıtma adımları her zaman pratik olmayabilir zorlu bir program yapar. Saflaştırma adımları en kısa sürede yapılması durumunda, 30 inkübasyon 2-4 saat gece ifade sonundan itibaren zaman ° C TEV proteaz ile yaklaşık 9-11 saattir. Duraklatmak için potansiyel bir yer TEV bölünme adım takip ediyor. Kesinlikle gerekli ise, Hsp104 ek bileşenini (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH (5T32GM008275 22) ve Amerikan Kalp Derneği (EAS) predoctoral dostluk bir hibe ile desteklenen; Kimya-Biyoloji Arabirimi NIH (2T32GM071339-06A1) (MED) Bursu; ve hibe NIH (1DP2OD002177-01 ve NS067354-0110), Ellison Tıp Vakfı ve Bill ve Melinda Gates Vakfı (JS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 |
| 2XYT broth | USB | 75864 |
| Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 1836170 |
| Pepstatin A | Sigma | P4265 |
| Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) | Millipore | UFC903008 |
| Resource Q – 6ml column | GE Healthcare | 17-1179-01 |
| proTEV Protease | Promega | V6052 |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575015 |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 |
| Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 |
| Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |
References
- Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System that Rescues Previously Aggregated Proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88, 1-13 (2010).
- Parsell, D. A., Sanchez, Y., Stitzel, J. D., Lindquist, S. Hsp104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites. Nature. 353, 270-273 (1991).
- Doyle, S. M., Wickner, S. Hsp104 and ClpB: protein disaggregating machines. Trends Biochem Sci. 34, 40-48 (2009).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16, 63-74 (2008).
- Glover, J. R., Lum, R. Remodeling of protein aggregates by Hsp104. Protein Pept Lett. 16, 587-597 (2009).
- Mogk, A., Haslberger, T., Tessarz, P., Bukau, B. Common and specific mechanisms of AAA+ proteins involved in protein quality control. Biochem Soc Trans. 36, 120-125 (2008).
- Grimminger-Marquardt, V., Lashuel, H. A. Structure and function of the molecular chaperone Hsp104 from yeast. Biopolymers. 93, 252-276 (2010).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248, 1112-1115 (1990).
- Sanchez, Y., Taulien, J., Borkovich, K. A., Lindquist, S. Hsp104 is required for tolerance to many forms of stress. Embo J. 11, 2357-2364 (1992).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137, 146-158 (2009).
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20, 125-1233 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6, 435-450 (2005).
- True, H. L., Berlin, I., Lindquist, S. L. Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits. Nature. 431, 184-187 (2004).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407, 477-483 (2000).
- Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, e294-e294 (2008).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268, 880-884 (1995).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Epigenetics in the extreme: prions and the inheritance of environmentally acquired traits. Science. 330, 629-632 (2010).
- Satpute-Krishnan, P., Langseth, S. X., Serio, T. R. Hsp104-dependent remodeling of prion complexes mediates protein-only inheritance. PLoS Biol. 5, e24-e24 (2007).
- Sweeny, E. A., Shorter, J. Prion proteostasis: Hsp104 meets its supporting cast. Prion. 2, 135-140 (2008).
- Lo Bianco, C. Hsp104 antagonizes alpha-synuclein aggregation and reduces dopaminergic degeneration in a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 118, 3087-3097 (2008).
- Narayanan, S., Walter, S., Reif, B. Yeast prion-protein, sup35, fibril formation proceeds by addition and substraction of oligomers. Chembiochem. 7, 757-765 (2006).
- Savistchenko, J., Krzewska, J., Fay, N., Melki, R. Molecular chaperones and the assembly of the prion Ure2p in vitro. J Biol Chem. 283, 15732-15739 (2008).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304, 1793-1797 (2004).
- Shorter, J., Lindquist, S. Destruction or potentiation of different prions catalyzed by similar Hsp104 remodeling activities. Mol Cell. 23, 425-438 (2006).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70 and Hsp40 interplay regulates formation, growth and elimination of Sup35 prions. Embo J. 27, 2712-2724 (2008).
- Doyle, S. M. Asymmetric deceleration of ClpB or Hsp104 ATPase activity unleashes protein-remodeling activity. Nat Struct Mol Biol. 14, 114-122 (2007).
- Wendler, P. Atypical AAA+ subunit packing creates an expanded cavity for disaggregation by the protein-remodeling factor Hsp104. Cell. 131, 1366-1377 (2007).
- Hinault, M. P. Stable alpha-synuclein oligomers strongly inhibit chaperone activity of the Hsp70 system by weak interactions with J-domain co-chaperones. J Biol Chem. 285, 38173-38182 (2010).
- Tipton, K. A., Verges, K. J., Weissman, J. S. In vivo monitoring of the prion replication cycle reveals a critical role for Sis1 in delivering substrates to Hsp104. Mol Cell. 32, 584-591 (2008).
- Bieschke, J., Cohen, E., Murray, A., Dillin, A., Kelly, J. W. A kinetic assessment of the C. elegans amyloid disaggregation activity enables uncoupling of disassembly and proteolysis. Protein Sci1. 8, 2231-2241 (2009).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313, 1604-1610 (2006).
- Cohen, E. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
- Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 23, 1191-11201 (2010).
- Carmichael, J. Bacterial and yeast chaperones reduce both aggregate formation and cell death in mammalian cell models of Huntington’s disease. Proc Natl Acad Sci. 97, 9701-9705 (2000).
- Vacher, C., Garcia-Oroz, L., Rubinsztein, D. C. Overexpression of yeast hsp104 reduces polyglutamine aggregation and prolongs survival of a transgenic mouse model of Huntington’s disease. Hum Mol Genet. 14, 3425-3433 (2005).
- Liu, Y. H. Heat Shock Protein 104 Inhibited the Fibrillization of Prion Peptide 106-126 and Disassembled Prion peptide 106-126 Fibrils in vitro. Int J Biochem Cell Biol. , (2011).
- Wendler, P., Saibil, H. R. Cryo electron microscopy structures of Hsp100 proteins: crowbars in or out. Biochem Cell Biol. 88, 89-96 (2010).
- Wendler, P. Motor mechanism for protein threading through Hsp104. Mol Cell. 34, 81-92 (2009).
- Lee, S., Sielaff, B., Lee, J., Tsai, F. T. CryoEM structure of Hsp104 and its mechanistic implication for protein disaggregation. Proc Natl Acad Sci. 107, 8135-8140 (2010).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Lindquist, S. Saccharomyces cerevisiae Hsp104 protein. Purification and characterization of ATP-induced structural changes. J Biol Chem. 269, 4480-4487 (1994).
- Schirmer, E. C., Queitsch, C., Kowal, A. S., Parsell, D. A., Lindquist, S. The ATPase activity of Hsp104, effects of environmental conditions and mutations. J Biol Chem. 273, 15546-15552 (1998).
- Schirmer, E. C., Ware, D. M., Queitsch, C., Kowal, A. S., Lindquist, S. L. Subunit interactions influence the biochemical and biological properties of Hsp104. Proc Natl Acad Sci. 98, 914-919 (2001).
- Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Cooperative kinetics of both Hsp104 ATPase domains and interdomain communication revealed by AAA sensor-1 mutants. EMBO J. 21, 12-21 (2002).
- Schirmer, E. C., Lindquist, S. Purification and properties of Hsp104 from yeast. Methods Enzymol. 290, 430-444 (1998).
- Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hsp104 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc Natl Acad Sci. 99, 2732-2737 (2002).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J Biol Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Lum, R., Tkach, J. M., Vierling, E., Glover, J. R. Evidence for an unfolding/threading mechanism for protein disaggregation by Saccharomyces cerevisiae Hsp104. J Biol Chem. 279, 29139-29146 (2004).
- Tessarz, P., Mogk, A., Bukau, B. Substrate threading through the central pore of the Hsp104 chaperone as a common mechanism for protein disaggregation and prion propagation. Mol Microbiol. 68, 87-97 (2008).
- Weibezahn, J. Thermotolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB. Cell. 119, 653-665 (2004).
