Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme

Summary

Özel microRNA mikroarray deneyler basit bir prosedür açıklanmıştır. Adımlar, RNA, etiketleme RNA ve referans DNA izole mikroarray'ler için örnekleri literatürde, mikroarray'ler tarama ve niceleme hibridizasyon sinyalleri analiz içerir.

Abstract

microRNA (miRNA'lar), yaygın olarak ^{ökaryotlarda} 1 olarak ifade edilir ~ 22 nükleotidler (nt) uzun RNA molekülleri büyük bir aileyiz . Kompleks genomların öncelikle bir çok sayıda post-transkripsiyonel hedef genlerin ^{2, 3} ekspresyonunu inhibe kullarak en az yüzlerce kodlayın. miRNA'lar biyolojik süreçlerin ¹ geniş bir kontrol eder. Buna ek olarak, değişen miRNA ifadesi, bu tür kanserleri gibi insan hastalıkları ile ilişkili olduğu ve miRNA'lar hastalıkları ^{ve prognozu 4,} 5 biyobelirteçleri olarak hizmet edebilir. Bu nedenle, ifade ve pek çok farklı koşullar altında miRNA'lar fonksiyonları anlamak önemlidir.

Real-time PCR, mikroarray ve derin sıralama: Üç büyük yaklaşımlar profil miRNA ifade istihdam edilmiştir. MiRNA mikroarray tekniği yüksek verimli olma avantajı, genellikle daha az pahalı, deney ve analiz adımları carr olabilirüniversiteler, tıp fakülteleri ve ilişkili hastaneler, bir moleküler biyoloji laboratuvarı ied. Burada, özel miRNA mikroarray deneyler için bir yöntem açıklanmaktadır. MiRNA miRNA mikroarray'ler prob seti üretmek için cam slaytlar basılacaktır. RNA küçük RNA türleri koruyan bir yöntem ya da reaktif kullanılarak izole edilmiş, ve ardından floresan bir boya ile etiketlenmiş. Kontrol olarak, miRNA'lar bir alt kümesi karşılık gelen referans DNA oligonükleotidler de farklı bir floresan boya ile işaretlenmiştir. Referans DNA slayt ve melezleşme kalitesini göstermek için hizmet verecek ve aynı zamanda veri normalleşmesi için kullanılacaktır. RNA ve DNA karışık ve veritabanı miRNA'lar en problar içeren bir mikroarray slayt melezleşmiştir. Yıkadıktan sonra, slayt görüntüler elde etmek için taranmış ve şiddetleri sayısal tek tek noktalar. Bu ham sinyalleri, ileri işlenmiş ve ilgili miRNA'lar ifade veri olarak analiz edilecektir. Microarray slaytlar microarrays maliyetini azaltmak ve tutarlılık mikroarray deneyler geliştirmek için elimden ve rejenere olabilir. Aynı usul ve esaslar özel mikroarray deneylerin diğer türleri için geçerlidir.

Protocol

1. Özel miRNA microarrays yazdırma

1. Mikroarray bir üniversite veya bir şirket mikroarray çekirdek tesisi hizmetleri kullanarak slaytlar yazdırın. Mikroarray imalat kalitesi mikroarray deneyinin başarısı için en önemli faktörlerden biridir. Mümkünse birkaç hizmetleri deneyin. İdeal olarak, bir seferde 50-100 slayt yazdırmak, ve tüm slaytları iyi ayrılmış, tek tek noktalar ile aynı bakacağız.
2. Mikroarray destek için, biz EKSİKLİK II kaplı slaytlar kullanın.
3. MiRNA probları için, NCode Multi-Türlerin Mikroarray Probe V2 Set miRNA kullanın.
4. 10 mcM 3 x SSC oligonükleotidler çözülür ve quadruply slaytları yazdırmak. GAAPS II slaytlar için talimatlara göre ultraviyole ışınlama slaytlar sabitleyin. Elmas kalemle basılı problar ile alan ve yan işaretlemek için bir slayt etiketleyin. Mağaza at 22 ° C

2. Örnek hazırlama

1. Herhangi bir yöntemveya reaktif sürece küçük RNA'lar korur, RNA izole etmek için kullanılan olabilir. Biz genellikle Trizol (Invitrogen), _A 260nm ve _A 280nm okumaları ile ölçülen RNA hazırlıkları yeterli miktar ve kalitede, toplam RNA ayıklamak için kullanın .
2. RNA etiketleme, 1 x tamponu (50 mM HEPES, pH 7.8, 20 mM MgCl _2, 10 mg / ml BSA,% 10 5'-PCU-DY547-3 ^'6 0.5 mikrogram ile toplam RNA karışımı ~ 25 mg için DMSO) içeren ~ 20 adet T4 RNA ligaz 1, ~ 10 mM DTT ve ATP için 10 x T4 RNA ligaz 1 tampon ~ 0,02-0,03 son hacmi ile desteklenebilir.
3. 2-24 saat boyunca bir buzdolabı içinde buz üzerinde devam etmek için etiketleme İzin. 0,3 M sodyum asetat ve etanol 3 cilt RNA çöktürün. Verimli ligasyonu ve yağış için, üzerinden 2 mg / ml total RNA çözülür ve ~ 20 ul toplam ligasyonu hacmi tutmak.
   1. Az RNA varsa, giriş RNA ve 5'-PCU-DY547-3 'Küçülmüş olabilir miktarı </ Li>
   2. RNA çok seyreltik ise, yağış yardım etmek için maya tRNA gibi taşıyıcı ekleyin.
4. Referans DNA oligonükleotidler memeli miRNA'lar Ulysis Alexa Fluor 647 Nükleik Asit Etiketleme Seti ⁶ hibridizasyon işlemi için bir kontrol olarak kullanarak bir alt kümesine karşılık gelen toplam 1 mcg birleştirin ve etiket . CentriSep bir sütunu kullanarak işaretli DNA arındırmak ve -20 ° C'de karanlıkta kaydetmek

3. Mikroarray hibridizasyon

1. Ilk kez slayt kullanmak için, 37 3 x SSC,% 0.1 SDS, 30-60 dakika süreyle% 0,2 BSA filtrelenmiş bir çözüm slaytları önceden melezleşme ° C Batmak su birkaç kez, sonra izopropanol. Az 5 dakika boyunca 22 100 g slayt adaptör ° C ile bir santrifüj kullanarak slaytları Kuru

Not: Biz mikroarray hibridizasyon gerçekleştirmek için Corning mikroarray hibridizasyon odaları ve Lifterslips Erie Bilimsel mSeries kullanın.

2. Li durulayınhava kurumadan su fterslips, daha sonra etanol,. Mikroarray hibridizasyon odasının tabanı içinde bir slayt ve slayt bir lifterslip üstüne yerleştirin. Lifterslip slayt iletişime beyaz şeritler ile prob alanı kapsayacaktır.
3. Karanlıkta, etiketli RNA çöktürülmüş aşağı doğru döndürün. % 70 etanol ile bir kez yıkayın ve hava pelet kuru. Pelet kırmızımsı olmalıdır.
4. 400 mM Na ₂ HPO _4, pH 7.0,% 0.8 BSA,% 5 SDS,% 12 saflaştırılmış 1/15-1/100 ul formamid ^6, RNA örnek başına etiketli referans DNA (2.4) içeren bir melezleşme çözüm hazırlayın. Eklendi referans DNA miktarı farklı oligonükleotidler (2.4) kaç etiketlenir bağlıdır. 100'ün üzerinde varsa, daha az seyreltme gereklidir.
5. RNA pelet ~ 60 ul hibridizasyon solüsyonu ile iyice eritin.
6. Corning mikroarray hibridizasyon odasının tabanı nemlendirici kuyuların her biri 20 ul su ekleyin.
7. T ekleslayt etiketli RNA ve referans DNA karışımı. Ince bir pipetlemeyin ucu kullanın lifterslip kenarına hafifçe dokunmak ve çözüm emme yoluyla lifterslip ve slayt arasındaki boşluk girmek için izin verir.
8. Hibridizasyon odasının tabanı üzerinde kapak yerine metal klipler, daha sonra Odanın mühür.
9. Corning oda kaset ile gelen plastik torba içinde bütün odasına koyun.
10. Islatılmış kağıt havlu ile bir kap içinde oda kaset (ler) yerleştirin; plastik wrap ile kabın kapağı ve 37 iç ° C ~ 24 saat boyunca nemli, hücre kültürü inkübatör. Bu önlemler (3.6, 3.9, 3.10), hibridizasyon çözüm inkübasyon sırasında kurumasına olmadığını garanti eder.

4. Post-hibridizasyon işleme

1. Oda kasetleri tek tek sökün. 22 2 x SSC Batmak bir slayt ve onun lifterslip ° C Lifterslip doğal slayt kapalı düşecek. 0.8 x SSC yerleştirin. Yıkamaiki kez, daha sonra 0.8 x SSC slaytlar 0,4 x SSC, toplam 1-2 dakika içinde üç kez. Slaytları slayt adaptör ile bir santrifüj kullanarak kurutun. Lifterslips su ile yıkayın ve daha sonra yeniden kullanmak için kaydedin.
2. Slaytlar uygun herhangi bir tarayıcı, örneğin, Perkin Elmer ScanArray 5000 veya Moleküler Cihazlar Axon GenePix 4000B mikroarray tarayıcı ile tarayın. Ilgili görüntü dosyalarını elde etmek için dalga boyları yaklaşık 547 nm ile 647 nm tarayın.
3. Girişi, 4.2 'den resim dosyaları) piksel yoğunlukları ölçmek için bu BlueFuse gibi programlar kullanın. Daha fazla dikkate mikrodizinlerinde anormal noktalar hariç programı ile tek tek noktalar kontrol edin. Bu anormal lekeler genellikle kötü slayt baskı veya slayt işleme hibridizasyon sonra ortaya çıkar.
4. Veri analizi ve sunumu için, GeneSpring ve Excel gibi programları kullanın. Mikroarray veri normalleşmesi için Genel hususlar geçerli olan bu yazının kapsamı dışındadır.
5. Bir kez tatmin edici sinyaller af elde edilirter 4.3), ⁷ için yeniden mikroarray slaytlar şerit. 10-20 dakika sonra önceden ısıtılmış 62 bir boyama çanak, 1 mM NaOH ve 0,1 x SSC ° C batırmayın, su kaydırağı durulayın. Inkübasyon kez tekrarlayın. 22 nazik sallayarak 60 dakika kadar su birkaç kez slaytlar ° C yıkayın Santrifüj kullanılarak slaytlar, ve 22 mağaza ° C kurulayın
6. Rejenere slaytlar kullanmak için, onları tekrar ön melezleşme gerekli değildir. Sadece izopropanol tarafından takip suda yıkayın ve slaytlar sağ hibridizasyon önce kuru.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Biz büyük ölçüde küresel miRNA ifade binlerce örnek profil açıklanan prosedürleri takip, yani, pek çok farklı koşullar altında insan örnek zebrafish izole RNA'lar. Şekil 1 çok hassas ve güçlü bir hibridizasyon sinyalleri göstermek için bir mikroarray taranmış bir görüntü gösterir kaydırın. Pearson correlatimükemmel tekrarlanabilirlik gösteren ~ 0.99 ^7, teknik arasındaki katsayıları mikroarray hibridizasyon, çoğaltır.

Hibridizasyon sonra taranan miRNA mikroarray slayt 1 Kompozit görüntü Şekil. Kırmızı noktalar, sarı lekeler, DNA ve RNA aynı sondaları tarafından döllemeler iken, referans DNA DY547 etiketli RNA örnek yeşil noktalar, döllemeler sonuçlandı.

Discussion

Mikroarray derin sıralama teknolojilerindeki son gelişmelere rağmen, DNA ve RNA yüksek verimlilik analizi için uygun bir seçenek kalır. Derin bir sıralama ile karşılaştırıldığında, mikroarray deneyler ucuzdur ve tipik bir moleküler biyoloji laboratuvarı deney ve esneklik sağlar ve zaman kazandırır veri analizi, in-house, en gerçekleştirebilirsiniz. Gelecekte, muhtemelen mikroarray'ler uygundur genler, örneğin setleri yoğun sorgulamak için, bir genom veya miRNA'lar transkripsiyon faktörlerinin tümünü ya da bir alt kümesi ve aynı ilke ve işlemler burada sunulan çalışmada özel mikroarray deneylerde kullanılır. miRNA'lar yanı sıra, gen aileleri. Tabii ki, mikroarray'ler hakkında önemli bir dezavantajı sırası bilgilerinin a priori kullanılabilir olmalıdır. Kaç miRNA genler var belirsizliğini koruyor olsa da, bu model organizmaların çoğu protein gen aileleri için bir sorun değildir. Prob seti kullanıyor miRBase ⁸ dayalı dizayn edilmiştir 9, 10, en bol ve en biyolojik ilgili memeli miRNA'lar zaten bu prob seti ile kaplı olduğu görülür.

Özel mikroarray deneyler gerçekleştirmek için önemli bir teknik zorlukları vardır. Yeterli miktarda kaliteli RNA hazırlamak ve iyi basılmış slayt, 2) elde etmek için) 1 ve 3) düzgün hibridizasyon sonra slaytlar yıkama: edindiğimiz deneyimlere dayanarak, mikroarray deney başarının anahtarları. Trizol reaktif genellikle, sonraki çalışmalar için sağlam RNA yeterli miktarda elde edilir. Bununla birlikte, miRNA ifadesi farklı doku ve hücre hatları arasında değişir. Ligasyon yöntemi ile etiketli en koşullar altında, total RNA 20-25 mikrogram yeterince güçlü mikroarray sinyaller vermelidir. Az RNA beyin bölgelerinde ve nöronlar gibi miRNA zengin örnekleri için gereklidir. Sadece 1-5 mikrogram toplam RNA veya daha az kullanılabilir, diğer etiketleme yöntemis örneğin, Invitrogen RNA etiketleme kitleri, kullanılan ve burada açıklanan özel mikroarray platformu ile uyumlu olabilir. En iyi karşılaştırmalar için, biri her zaman aynı anda tüm deney ve kontrol örnekleri çoğaltmak en az bir etiket olmalı ve onları tek bir deneyde slaytlar aynı baskı toplu melezleşme. Bu araştırma, tasarım, örnek etiketleme ve işleme ve slayt kalite varyasyonları kaynaklanan diferansiyel mikroarray sinyalleri katkı en aza indirecektir. Referans DNA (kırmızı kanalında), slayt, hibridizasyon ve yıkama kalitesi için bir denetim olarak hizmet vermektedir. Başarılı bir hibridizasyon kırmızı temiz ve güçlü sinyaller verecektir. DNA sinyalleri iyi ama RNA sinyalleri değilseniz, sonra bir RNA izolasyonu ve etiketleme adımları sorunsuz bir ateş gerekir. Örneğin, RNA oranı 1.9 ve 2.1 arasında A / A _{280nm 260nm} var mı? Pelet kırmızımsı 3.3 mı?

Çoğu yatırımmikroarray'ler için slayt baskı ve tarama için olabilir. Mikroarray yazıcı ve bir tarayıcı, genellikle birçok üniversite ve tıp fakültelerinde temel tesisi ile donatılmış. Dökme ve yeniden slaytlar ve lifterslips Baskı mikroarray'ler maliyeti önemli ölçüde azaltacaktır. Tekrar kullanımı slayt mikroarray deneyler ⁷ tutarlılığını geliştirmek ek bir avantaja sahiptir. Biz slaytlar fazla altı kez yeniden ve veri kalitesi hala tatmin edici bulduk. Ancak, en az girdi RNA'lar ile en değerli örnekleri veya örnek için en iyi hassasiyeti sağlamak için, hala ^taze slaytlar 7 kullanmak için ihtiyatlı olduğunu.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies