बायोमास एनजाइम डिस्कवरी और कॉकटेल अनुकूलन के लिए एक स्वचालित प्लेटफार्म: GENPLAT

Summary

GENPLAT (GLBRC एनजाइम मंच) और बायोमास गिरावट के लिए एंजाइम कॉकटेल की खोज अनुकूलन के लिए एक स्वचालित प्लेटफार्म है. यह कई घटकों से युक्त एंजाइमों के कई feedstocks और मिश्रण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. एनजाइम उत्पादन वैक्टर pPICZ या pPICZα में इसी जीन की क्लोनिंग और पी. में परिवर्तन द्वारा Pichia pastoris में प्रोटीन का निर्माण pastoris. चकित 500 मिलीलीटर की बोतल में मेथनॉल प्रेरण के साथ 300 मिलीलीटर बैचों में कोशिकाओं को विकसित हर 24 घंटा (बनर्जी एट अल, 2010a). ध्यान लगाओ और स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन द्वारा संस्कृति filtrates फीका बनाना. 20% ग्लिसरॉल में -80 पर स्टोर छोटे aliquots में एंजाइमों डिग्री सेल्सियस एकाग्रता रेंज 1-10 मिलीग्राम / मिलीलीटर है. 2. प्रयोग के डिजाइन एंजाइमों के इनपुट संख्या परीक्षण किया है, उनके ऊपरी और कम अनुपात (कोर एंजाइमों के लिए 5% की एक कम अनुपात जैसे), और डिजाइन Expertsoftware में प्रयोगात्मक डिजाइन (उदाहरण के लिए, द्विघात या घन) के प्रकार. प्रत्येक करने के लिए 15 मिलीग्राम / छ glucan की कुल लोड हो रहा है बनाने के लिए जोड़ा जा एंजाइम की μg में राशि की गणना, और तब μl में एक एंजाइम की मात्रा को जोड़ने की गणनाप्रत्येक प्रतिक्रिया. Excel प्रयोगात्मक डिजाइन और यह Biomek FXP सॉफ्टवेयर में आयात और हस्तांतरण समारोह से फ़ाइल का उपयोग कर के अनुसार पानी और एंजाइमों के वितरण के लिए स्रोत labware, स्रोत कुओं, गंतव्य labware, गंतव्य कुओं, और हस्तांतरण मात्रा निर्दिष्ट कार्यपत्रक उत्पन्न करता है. 3. Enzymatic hydrolysis 50 मिमी सोडियम साइट्रेट, 4.8 पीएच में बायोमास घोल निलंबित, 5 μg / एमएल टेट्रासाइक्लिन और 5 cycloheximide / μg मिलीलीटर युक्त चप्पू जलाशय में. एक 96 – अच्छी तरह से गहरे अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेटों में से प्रत्येक के कुएँ में robotically pipet 200 घोल μl अवधि काट पिछले 0.5 सेमी के साथ 8 1000 μl pipet सुझावों का उपयोग कर. गारा 100 μl / सेकंड पर एक बार और मिक्स तो चप्पू जलाशय से एक ही मात्रा महाप्राण (व्यंजन) और प्लेटों में बांटना. Beckman FX में प्रवेश प्रोग्राम का उपयोग कर एक ही थाली में एंजाइमों बग़ैर. Pierceable capmats के साथ सील प्लेटें. उलटें और नलप्लेटों कई बार सतह के तनाव पर काबू पाने के लिए. संकरण इनक्यूबेटर घूर्णन में 10 rpm पर 48 घंटे के लिए 50 ° C पर प्लेटें प्लेस. 4. GLC और Xyl के निर्धारण झूल बाल्टी अपकेंद्रित्र में 1250 XG में 3 मिनट के लिए प्रतिक्रिया प्लेटें अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला की नियमित रूप से 96 अच्छी तरह Biomek FX के AP96 फली का उपयोग प्लेटों में 100 μl स्थानांतरण. 90-95 में प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस क्रम में एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए, और फिर 30 सेकंड के लिए 1250 XG अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए. GLC माप के लिए नियमित रूप से 96 अच्छी तरह प्लेटें में supernatants के 12 μl हस्तांतरण. ग्लूकोज अभिकर्मक / oxidase peroxidase (GOPOD) के 192 μl जोड़ें. प्लेटें 50 ° C पर 20 मिनट के लिए सेते हैं और एक microplate रीडर में 510 एनएम absorbances पढ़ें. खाली नहीं एंजाइम के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण है. Xyl माप के लिए, 384 अच्छी तरह प्लेटें में 4 μl हस्तांतरण. परख अभिकर्मकों जोड़ें और 340 एनएम पर प्लेटें पढ़ें. रिक्तकोई एंजाइम के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण है. 5. डेटा विश्लेषण उनके% GLC और Xyl पैदावार ज्ञात GLC और मूल बायोमास के Xyl सामग्री पर आधारित absorbance के मूल्यों में कनवर्ट करें. सॉफ्टवेयर डिजाइन के विशेषज्ञ में प्रतिक्रियाओं के रूप में इन प्रतिशत आयात. सांख्यिकीय paramenters की जाँच के लिए यकीन है कि एक मजबूत मॉडल के लिए मापदंड को पूरा कर रहे हैं. सबसे अच्छा मॉडल भविष्यवाणी प्रयोगात्मक पुष्टि करें. 6. GENPLAT के साथ प्रतिनिधि परिणाम: व्यक्तिगत शुद्ध प्रोटीन के अनुकूलित मिश्रण का निर्माण (1). परिणामों से संकेत मिलता है जो एंजाइमों महत्वपूर्ण हैं, और क्या अनुपात में और भी एंजाइम जो महत्वपूर्ण नहीं हैं. कुछ प्रोटीन है कि टी. में प्रचुर मात्रा में हैं reesei (Nagendran एट अल., 2009) secretome Cip1 और Cip2 जैसे, GLC रिलीज में मकई पशुओं का चारा अमोनिया फाइबर (AFEX) विस्तार या क्षारीय hyd द्वारा pretreated से कोई भूमिका निभाते दिखाई देते हैं rogen (AHP) पेरोक्साइड (बनर्जी एट अल, 2010b). दूसरी ओर, कुछ प्रोटीन को अप्रत्याशित रूप से महत्वपूर्ण हैं. उदाहरण के लिए, Glycosyl Hydrolase 10 और 11 परिवारों के एंडो – xylanases दोनों GLC रिहाई के लिए महत्वपूर्ण हैं, एक xylanase अन्य (ग बनर्जी एट अल, 2010b) के लिए नहीं स्थानापन्न कर सकते हैं. Cel61A, टी. में एक छोटी सी प्रोटीन reesei secretome, GLC के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, लेकिन Xyl रिलीज नहीं है. कुछ एंजाइमों GLC और Xyl दोनों की रिहाई के लिए महत्वपूर्ण हैं, जबकि दूसरों को केवल एक या अन्य (बनर्जी एट अल., 2010c) के लिए आवश्यक हैं. एक सिंथेटिक 0.94 मिलीग्राम / एमएल (यानी, एक गैर अनुकूलित मिश्रण) के एक एकाग्रता में 16 घटक, प्रत्येक युक्त मिश्रण, डीडीजी AFEX – pretreated से उपलब्ध GLC के 38% का विमोचन किया. समान hydrolysis शर्तों के तहत, एक अनुकूलित मिश्रण है, जो 0% से 32% करने के लिए 16 घटकों के सांद्रता लेकर, GLC के 52% जारी (छवि 2). इस प्रयोग परिभाषित मिश्रण के निर्माण की उपयोगिता दिखाता है. _content "> (2) विभिन्न pretreatment / सब्सट्रेट संयोजन के लिए अनुकूलित कॉकटेल के निर्माण वर्तमान वाणिज्यिक cellulase तैयारी कर रहे हैं." एक आकार फिट बैठता सभी "वास्तव में, सबसे अच्छा कॉकटेल दोनों सब्सट्रेट और pretreatment पर एक एकल उत्पाद पर निर्भर करता है.. जैसे 1000 Accellerase से अलग एक ही रास्ते में pretreated substrates, और विभिन्न pretreatments (1 छवि) को उजागर उसी सब्सट्रेट से अलग पैदावार देता है हम GENPLAT का इस्तेमाल किया है करने के लिए कई pretreatments और mutiple feedstocks (बनर्जी एट के लिए शुद्ध एंजाइमों के मिश्रण का अनुकूलन. अल, 2010c). चित्रा 2 से पता चलता है कि किस तरह 16 शुद्ध एंजाइमों के इष्टतम एंजाइम अनुपात AFEX – pretreated मकई पशुओं का चारा, AHP – pretreated मकई पशुओं का चारा, और AFEX pretreated डीडीजी के लिए अलग है केवल 11 एंजाइमों छवि में दिखाया जाता है. 2 इष्टतम क्योंकि अन्य पांच (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2, और Cel12A) के अनुपात करने के लिए 0% (बनर्जी एट अल., 2010c) पाए गए. (3) उपन्यास एंजाइम की खोज </strong>. शुद्ध प्रोटीन के अनुकूलित मिश्रण के निर्माण एक सतत प्रक्रिया है. नए प्रोटीन के रूप में शुद्ध रूप (वाणिज्यिक स्रोतों से heterologous अभिव्यक्ति के द्वारा, या शुद्धि के द्वारा) में उपलब्ध हो जाते हैं, वे व्यवस्थित वर्तमान अनुकूलित सेट करने के लिए उन्हें जोड़ने के द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. GLC या Xyl करने के लिए योगदान उपन्यास प्रोटीन है कि तब एक नए, अनुकूलित सेट का हिस्सा बन रिलीज. इस तरह, GENPLAT बायोमास deconstruction के लिए नए एंजाइमों की पहचान के लिए एक मंच बन जाता है. हम टी. की तुलना में अन्य कवक के अर्क बना दिया है reesei और ए नाइजर अलग substrates पर हो गया है. एक विशेष निकालने GLC उपज बढ़ाया जब हमारे कोर सेट करने के लिए जोड़ा है. जिम्मेदार प्रोटीन और शुद्ध करने के लिए एक उपन्यास glycosyl वर्तमान (बनर्जी और वाल्टन, अप्रकाशित परिणाम) किसी भी व्यावसायिक एंजाइम तैयारी में hydrolase नहीं होना दिखाया था. (4) बेहतर एंजाइमों के डिस्कवरी. एक की गिरावट के लिए GENPLAT जो एंजाइमों सबसे महत्वपूर्ण हैं के साथ दिखायाविशेष रूप से बायोमास, हम एक बेहतर समझ है जिनमें से एंजाइमों सुधार के लिए ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए है. महत्वपूर्ण एंजाइमों का बेहतर उदाहरण प्रकृति में खोज के द्वारा पाया जा सकता है या प्रोटीन इंजीनियरिंग के द्वारा बनाई गई है. (एक एंजाइम है "बेहतर" कई मायनों में अपनी टी. reesei homolog वांछित संपत्ति पर निर्भर करता है की तुलना सकता है, उदाहरण के लिए, उच्च विशिष्ट गतिविधि, अधिक से अधिक तालमेल, proteolytic संवेदनशीलता, या बढ़ाया थर्मल स्थिरता में कमी). GENPLAT संभावित बेहतर एंजाइमों को परख करने की क्रिया के लिए एक सार्थक मंच प्रदान करता है, क्योंकि यह एक वास्तविक जटिल कॉकटेल (महत्वपूर्ण है क्योंकि कोई बायोमास एंजाइम अलगाव में काम करता है) और एक यथार्थवादी (सब्सट्रेट महत्वपूर्ण इस्तेमाल क्योंकि शुद्ध सेलूलोज़ या अन्य कृत्रिम substrates के साथ परिणाम प्राकृतिक lignocellulosic के लिए प्रासंगिक नहीं हो सकता है सामग्री). (5) वाणिज्यिक एंजाइम अनुकूलन. शुद्ध एंजाइमों की पर्याप्त बड़ी मात्रा में असली दुनिया में अभी तक मौजूद नहीं है. जब तक वे करते हैं, इथेनॉल समर्थकducers Accellerase 1000 और MultifectXylanase जैसे वाणिज्यिक उत्पादों पर भरोसा करना चाहिए. हालांकि, वाणिज्यिक एंजाइमों के मिश्रण आमतौर पर किसी भी व्यक्ति की तुलना में बेहतर प्रदर्शन, और GENPLAT कई वाणिज्यिक एंजाइमों के अनुकूलित कॉकटेल डिजाइन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 3 GENPLAT के उपयोग से पता चलता है कि चार वाणिज्यिक एंजाइम की तैयारी का एक मिश्रण का अनुकूलन. GLC AFEX – pretreated उपमहानिदेशक से रिहाई के लिए इष्टतम अनुपात 47 Accellerase1000%, 27%, 22% Multifect Pectinase 188 Novozyme, और 4% Multifect Xylanase (बनर्जी एट अल., 2010c) पाए गए. चित्रा 3B AFEX – उपमहानिदेशक से GLC उपज में चार एंजाइम की तैयारी के साथ मतभेद से पता चलता है, अनुकूलित वाणिज्यिक मिश्रण Accellerase1000 अकेले से SpezymeCP अकेले, या एक 16 घटक सिंथेटिक मिश्रण उच्च GLC उपज देता है इस प्रयोग को भी इंगित करता है कि 16 घटक सिंथेटिक मिश्रण एक या एक से अधिक इष्टतम GLC रिहाई, जो एक या अधिक वाणिज्यिक एंजाइमों के में मौजूद हैं के लिए आवश्यक एंजाइमों याद आ रही है. GENPLAT हमें किया जा सकता हैएड जैसे घटकों की पहचान करने के लिए. चित्रा 1. कोई भी वाणिज्यिक एंजाइम तैयारी सभी substrates और सभी pretreatments के लिए इष्टतम है . पांच substrates और तीन pretreatments पीस (0.5 मिमी कण आकार) के समान शर्तों के तहत की तुलना में थे, एंजाइम (15 मिलीग्राम / छ glucan) लोड हो रहा है, और hydrolysis शर्तों (48 घंटा, 50 डिग्री सेल्सियस) अलग AFEX pretreated substrates के पाचन. ए 1000 Accellerase के साथ मकई पशुओं का चारा बी पाचन 1000 Accellerase के साथ तीन अलग अलग तरीकों (बनर्जी एट अल देखें. 2010c) द्वारा pretreated. चित्रा 2 GLC AFEX – pretreated मकई पशुओं का चारा (AFEX – सीएस), क्षारीय हाइड्रोजन पेरोक्साइड pretreated मकई पशुओं का चारा (AHP सीएस), या सूखे AFEX pretreated से रिहाई के लिए 11 एंजाइमों के इष्टतम अनुपात गढ़ने.'नेताओं अनाज (AFEX डीडीजी). डेटा बनर्जी एट अल से कर रहे हैं. (2010c). सलाखों के शीर्ष के साथ नंबर GLC पैदावार बायोमास नमूने में कुल GLC के एक प्रतिशत के रूप में कर रहे हैं. चित्रा 3 ए. GENPLAT का उपयोग करने के लिए चार GLC के उपमहानिदेशक AFEX – pretreated से रिहाई के लिए वाणिज्यिक एंजाइम की तैयारी की एक अनुकूलित मिश्रण का उत्पादन. Multifect Xylanase छोटी योगदान (4%) बनाया था और इसलिए इस त्रिगुट आरेख से लोप कर दिया बी GLC पैदावार AFEX – उपमहानिदेशक से समान hydrolysis शर्तों (15 मिलीग्राम / छ glucan एंजाइम, 48 घंटे, 50 डिग्री सेल्सियस) के तहत विभिन्न एंजाइम उपचार के साथ. . चित्र में दिखाया प्रयोग से निर्धारित अनुपात "चार घटक वाणिज्यिक" है. 3A.

Discussion

यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि एंजाइमों की लागत को कम करने के एक किफायती lignocellulosic इथेनॉल उद्योग के विकास के लिए महत्वपूर्ण है. वर्तमान में उपलब्ध वाणिज्यिक एंजाइम कॉकटेल कई प्रोटीन (Nagendran एट अल., 2009) के जटिल मिश्रण और खराब परिभाषित कर रहे हैं, और वे मुख्य रूप से एसिड pretreated मकई पशुओं का चारा उपयोग के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. आदेश में बेहतर एंजाइम कॉकटेल के विकास में तेजी लाने के लिए, कई प्रयोगशालाओं एंजाइम की खोज और लक्षण वर्णन के लिए उच्च throughput प्लेटफार्मों को विकसित किया है. , डेकर एट एंजाइमों और बायोमास slurries के रोबोट वितरण, प्रयोग के सांख्यिकीय डिजाइन, और / या GLC के स्वचालित दृढ़ संकल्प और Xyl (बर्लिन एट अल, 2007: इस क्षेत्र में प्रयास शामिल है एक या एक से अधिक निम्नलिखित गुण भी GENPLAT में पाया अल, 2009, किम एट अल, 1998; राजा एट अल, 2009).. GENPLAT पहले इन प्रयासों फैली हुई है, एंजाइम मिश्रण की जटिलता है कि ज्यादा से ज्यादा 6 घटकों से विश्लेषण किया जा सकता में सबसे महत्वपूर्णहमारे नवीनतम काम में पिछले 16 से अधिक करने के लिए अध्ययन (बनर्जी एट अल., 2010c). अंत अंत रोटेशन से पाचन के दौरान कोमल मिश्रण; और ग्लू और Xyl के स्वचालित वर्णमिति दृढ़ संकल्प GENPLAT के अतिरिक्त प्रमुख विशेषताओं एक मनका मिश्रण कक्ष का उपयोग (चप्पू जलाशय) है कि पशुओं का चारा वितरण के दौरान निलंबित slurries रख सकते हैं कर रहे हैं.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)