GENPLAT: uma plataforma automatizada para Discovery Biomassa Enzima e Otimização Cocktail

Summary

GENPLAT (Enzyme GLBRC Platform) é uma plataforma automatizada para a descoberta e otimização de coquetéis enzimáticos para a degradação da biomassa. Ele pode ser adaptado para matérias-primas múltiplas e misturas de enzimas contendo vários componentes.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. Produção da enzima Produzir proteínas em Pichia pastoris por clonagem dos genes correspondentes em vetores pPICZ ou pPICZα e transformação em P. pastoris. Cultivar células em 300 ml em lotes perplexo de 500 ml frascos com a indução de metanol cada hr 24 (Banerjee et al., 2010a). Concentrar e dessalinizar os filtrados de cultura por filtração de fluxo tangencial. Armazenar as enzimas em pequenas alíquotas em glicerol 20% a -80 ° C. A faixa de concentração é 1-10 mg / ml. 2. Design da Experiência Introduza o número de enzimas a serem testados, o seu superior e proporções mais baixas (por exemplo, uma menor proporção de 5% para enzimas core), e do tipo de projeto experimental (por exemplo, quadrática ou cúbica) para o Design-Expertsoftware. Calcular a quantidade em mg de cada enzima para ser adicionado ao fazer uma carga total de 15 glucan mg / g, e depois calcular a quantidade de cada enzima em mL para adicionarcada reação. Gerar planilhas do Excel especificando labware fonte, poços fonte, material de laboratório de destino, poços de destino, e os volumes de transferência para distribuição de água e enzimas de acordo com o delineamento experimental e importá-lo para o software FXP Biomek usando a função de transferência-do-arquivo. 3. A hidrólise enzimática Suspender a suspensão de biomassa em 50 mM de citrato de sódio, pH 4,8, contendo 5 mg / ml de tetraciclina e 5 cicloheximida mcg / ml, no reservatório de remo. Roboticamente pipeta 200 mL da suspensão em cada poço de uma placas de 96 poços profundos bem-Span reação utilizando-8 dicas 1000-Pipete com os últimos 0,5 centímetros cortada. Misture a pasta uma vez em 100 l / seg e depois aspirar o mesmo volume do reservatório paddle e dispensar para as placas. Dispense as enzimas para a mesma placa usando o programa entrou no FX Beckman. Selar as placas com capmats perfurável. Inverter e toqueas placas diversas vezes para vencer a tensão superficial. Coloque as placas a 50 ° C por 48 h em incubadora a hibridização girando a 10 rpm. 4. Determinação de Glc e XYL Centrifugar as placas de reação para 3 min a 1250 xg em uma centrífuga de caçamba móvel. Transferência de 100 ml do sobrenadante para regulares placas de 96 poços usando o pod AP96 do FX Biomek. Incubar as placas a 90-95 ° C por 10 min, a fim de inativar as enzimas, e, em seguida, centrifugar a 1250 xg por 30 seg. Para medições Glc, transferir 12 mL do sobrenadante em regulares placas de 96 poços. Adicionar 192 mL do reagente glicose oxidase / peroxidase (GOPOD). Incubar as placas a 50 ° C por 20 min e ler as absorvâncias a 510 nm em um leitor de microplacas. Em branco é mistura de reação sem enzima. Para medições XYL, transferência de 4 mL em 384 poços pratos. Adicionar os reagentes de ensaio e ler as placas a 340 nm. Em brancoé a mistura de reação sem enzima. 5. Análise de Dados Converter os valores de absorbância ao seu Glc% e os rendimentos XYL baseado no Glc conhecido e conteúdo XYL da biomassa original. Importar esses percentuais como as respostas para o software de Design-Expert. Verifique o paramenters estatísticos a certeza de que os critérios para um modelo robusto são cumpridas. Confirmar a previsão de melhor modelo experimental. 6. Resultados representante com GENPLAT: (1) Criação de misturas otimizadas de proteínas individuais puro. Os resultados indicam que as enzimas são importantes, e em que proporções, e também quais as enzimas não são importantes. Algumas proteínas que são abundantes na T. reesei secretome (Nagendran et al., 2009), como CIP1 e CIP2, parecem desempenhar nenhum papel na libertação de Glc palha de milho pré-tratados pela expansão de amônia fibra (AFEX) ou alcalina hyd rogen peróxido (AHP) (Banerjee et al., 2010b). Por outro lado, algumas proteínas são inesperadamente importante. Por exemplo, endo-xilanases de famílias hydrolase glicosil 10 e 11 são ambos importantes para Glc libertação; uma xilanase não pode substituir o outro (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, uma proteína menor no T. reesei secretome, é muito importante para Glc mas não XYL lançamento. Algumas enzimas são importantes para a liberação de ambos os Glc e XYL, enquanto outras são necessárias apenas para um ou outro (Banerjee et al., 2010C). A mistura sintética contendo 16 componentes, cada um com uma concentração de 0,94 mg / ml (ou seja, uma mistura não-otimizado), lançado 38% do Glc disponível a partir de pré-tratamento AFEX DDG. Em condições idênticas de hidrólise, uma mistura optimizada, em que as concentrações dos 16 componentes variou de 0% a 32%, liberado 52% do Glc (Fig. 2). Este experimento ilustra a utilidade da construção de misturas definidas. _content "> Criação (2) de cocktails otimizado para pré-tratamento diferente / combinações de substrato. atual celulase preparações comerciais são" one-size-fits-all ". Na realidade, o melhor cocktail depende tanto do substrato e pré-tratamento. Um produto único como Accellerase 1000 dá rendimentos diferentes dos diferentes substratos pré-tratados da mesma forma, e do mesmo substrato exposto a diferentes pré-tratamentos (Fig. 1). Usámos GENPLAT para otimizar misturas de enzimas pré-tratamentos puro para múltiplas e matérias-primas mutiple (Banerjee et al., 2010C). Figura 2 mostra como as proporções de enzima ideal de 16 enzimas pura difere para AFEX pré-tratamento palha de milho, AHP pré-tratamento palha de milho, e AFEX pré-tratamento DDG. Apenas 11 enzimas são mostrados na Figura 2. porque o ideal proporções dos outros cinco (Cel61B, AbfB, CIP1, CIP2 e Cel12A) foram encontrados para ser 0% (Banerjee et al., 2010C). (3) a descoberta de enzimas Novel </strong>. A construção de misturas otimizadas de proteínas pura é um processo contínuo. Como novas proteínas tornam-se disponíveis na forma pura (a partir de fontes comerciais, por expressão heteróloga, ou purificação), eles podem ser sistematicamente testados, adicionando-os ao conjunto atual otimizada. Novas proteínas que contribuem para Glc ou XYL release então tornar-se parte de um conjunto novo e otimizado. Desta forma, torna-se GENPLAT uma plataforma para a identificação de novas enzimas para a desconstrução da biomassa. Fizemos extratos de outros fungos que T. reesei e A. niger cultivado em diferentes substratos. Um extrato particular impulsionou o rendimento Glc quando adicionado ao nosso conjunto central. A proteína responsável foi purificada e demonstrou ser um romance glicosil hidrolase não está presente em qualquer preparação enzimática comercial (Banerjee e Walton, resultados não publicados). (4) A descoberta de enzimas melhor. Tendo mostrado com GENPLAT enzimas que são mais importantes para a degradação de umabiomassa particular, temos uma melhor compreensão de quais enzimas deve ser o foco para a melhoria. Melhores exemplos das enzimas crítica pode ser encontrada através de pesquisa na natureza ou obtidos por engenharia de proteínas. (Uma enzima poderia ser "melhor" do que o seu homólogo T. reesei de várias maneiras, dependendo da propriedade desejada, atividade, por exemplo, mais específicos, maior sinergia, diminuição da sensibilidade proteolítica, ou estabilidade térmica melhorada). GENPLAT fornece uma plataforma significativa para a dosagem de enzimas potencialmente melhor, porque ele utiliza um cocktail realisticamente complexas (importante porque nenhuma enzima biomassa funciona isoladamente) e um substrato realista (importante porque os resultados com celulose pura ou outros substratos artificiais não podem ser relevantes para lignocelulósicos naturais materiais). (5) otimização da enzima comercial. Quantidades suficientemente grande de enzimas puras ainda não existem no mundo real. Até que o façam, o etanol protores deve confiar em produtos comerciais, como Accellerase 1000 e MultifectXylanase. No entanto, as misturas de enzimas comerciais geralmente têm melhor desempenho do que qualquer um indivíduo, e GENPLAT pode ser usada para projetar cocktails otimizado de várias enzimas comerciais. A Figura 3 mostra o uso de GENPLAT para otimizar uma mistura de quatro preparações de enzimas comerciais. As proporções ideais para a liberação de Glc AFEX de pré-tratamento DDG foram encontrados para ser 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, e 4% Multifect xilanase (Banerjee et al., 2010C). Figura 3B mostra as diferenças no rendimento de AFEX Glc-DDG com quatro preparações enzimáticas; a mistura otimizada comerciais dá maior rendimento do que Glc Accellerase1000 sozinho, SpezymeCP sozinho, ou uma mistura de 16 componentes sintéticos. Esta experiência também indica que a mistura de 16 componentes sintéticos está faltando uma ou mais enzimas necessárias para uma ótima Glc lançamento, que estão presentes em uma ou mais das enzimas comerciais. GENPLAT pode ser-nosed para identificar tais componentes. Figura 1. Nenhuma preparação única enzima comercial é ideal para todos os substratos e todos os pré-tratamentos. Cinco substratos e três pré-tratamentos foram comparados em condições similares de moagem (0,5 milímetros de tamanho de partículas), enzima de carga (15 mg glucana / g), e as condições de hidrólise (48 hr, 50 ° C) Digestão. A. de diferentes substratos AFEX pré-tratamento com Accellerase 1000. B. A digestão de palha de milho pré-tratados por três métodos diferentes, com Accellerase 1000 (ver Banerjee et al., 2010C). Figura 2. Proporções Optimal de 11 enzimas para liberação de Glc AFEX de pré-tratamento palha de milho (AFEX-CS), peróxido de hidrogênio alcalino pré-tratamento palha de milho (AHP-CS), ou pré-tratamento AFEX secas destilargrãos ers "(AFEX-DDG). Os dados são do Banerjee et al. (2010C). Números ao longo do topo das barras são os rendimentos Glc como uma porcentagem do Glc total na amostra de biomassa. Figura 3. A. O uso de GENPLAT para produzir uma mistura optimizada de quatro preparações de enzimas comerciais para liberação de Glc AFEX de pré-tratamento DDG. Multifect xilanase fez a menor contribuição (4%) e, portanto, omitidos neste diagrama ternário. Rendimentos B. Glc de AFEX-DDG com tratamentos diferentes enzimas em condições idênticas de hidrólise (15 enzima glucano mg / g, 48 h, 50 ° C) . "Four-componente comercial" tem as proporções determinadas a partir do experimento mostrado na figura. 3A.

Discussion

É amplamente reconhecido que a redução do custo das enzimas é importante para o desenvolvimento de uma indústria de etanol lignocelulósico econômica. Atualmente disponíveis coquetéis enzimáticos comerciais são misturas complexas e mal definidas de muitas proteínas (Nagendran et al., 2009), e eles são adaptados principalmente para uso em pré-tratamento ácido palha de milho. A fim de acelerar o desenvolvimento de cocktails melhor enzima, vários laboratórios têm desenvolvido high-throughput plataformas para a descoberta e caracterização de enzimas. Esforços nesta área têm incorporado um ou mais das seguintes propriedades também encontrada em GENPLAT: dispensa robótico de enzimas e suspensões de biomassa, a concepção estatística de experimento, e / ou determinação automatizada de Glc e XYL (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT estende esses esforços anteriores, mais significativamente na complexidade das misturas de enzimas que podem ser analisados ​​a partir de no máximo seis componentes emos estudos mais cedo para mais de 16 no nosso mais recente trabalho (Banerjee et al., 2010C). Adicionais das principais características do GENPLAT são o uso de uma câmara de talão de mistura (reservatório de paddle) que pode manter pastas suspensas durante stover dispensação; suave mistura durante a digestão até o final de over-final da rotação, e determinação colorimétrica automatizada de Glu e XYL.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)