GENPLAT: Автоматизированная платформа для биомассы Открытие ферментов и коктейль-оптимизации

Summary

GENPLAT (GLBRC Фермент Platform) представляет собой автоматизированную платформу для обнаружения и оптимизации фермента коктейли для деградации биомассы. Он может быть адаптирован к нескольким сырья и смеси ферментов, содержащих несколько компонентов.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. Фермент производства Продукция белков в Pichia pastoris путем клонирования соответствующих генов в векторы pPICZ или pPICZα и превращения в П. pastoris. Рост клеток в 300-мл партий в тупик 500-мл колбы с метанолом индукции каждые 24 ч (Банерджи и соавт., 2010a). Концентрат и опреснения культуры фильтратов по тангенциальной фильтрации потока. Магазин ферменты в небольших порции в 20% глицерине при -80 ° C. Диапазон концентраций составляет 1-10 мг / мл. 2. Планирование эксперимента Введите число ферментов, чтобы быть проверены, их верхние и нижние пропорции (например, меньшая доля в размере 5% для основных ферментов), и тип экспериментального проектирования (например, квадратичной или кубической) в дизайн-Expertsoftware. Рассчитать сумму в мкг каждого фермента, которые будут добавлены, чтобы общая нагрузка от 15 мг / г глюкан, а затем вычислить количество каждого фермента в мкл, чтобы добавить ккаждой реакции. Создание листов Excel указанием источника лабораторного оборудования, источник скважин, назначение лабораторного оборудования, назначение скважин, и передача объемов для дозирования воды и ферментов в соответствии с опытно-конструкторских и импортировать его в программное обеспечение Biomek FXP использованием трансфертного из-файл функции. 3. Ферментативного гидролиза Приостановить биомассы суспензии в 50 мМ цитрат натрия, рН 4,8, содержащий 5 мкг / мл тетрациклина и 5 мкг / мл циклогексимид, в весла водохранилище. Робота пипетки 200 мкл раствора в каждую лунку 96-луночного глубоких скважин пластин реакции с помощью Span-8 1000 мкл пипетки советы с последними 0,5 см отрезать. Смешайте суспензии один раз в 100 мкл / сек, а затем аспирата же объемом от весла водохранилища и обойтись в пластинах. Внесите ферментов в одной тарелке с помощью программы вступил в Beckman FX. Уплотнение пластин с pierceable capmats. Обратить и нажмитепластин несколько раз, чтобы преодолеть поверхностное натяжение. Место пластин при 50 ° С в течение 48 ч в гибридизация инкубатора вращающихся в 10 оборотов в минуту. 4. Определение Glc и XYL Центрифуга реакция пластины в течение 3 мин при 1250 мкг в размахивая ведром центрифуги. Передача 100 мкл надосадочной в обычную 96-луночных использования AP96 стручок Biomek FX. Инкубируйте пластин при 90-95 ° С в течение 10 минут для того, чтобы инактивировать ферменты, а затем центрифуге при 1250 мкг в течение 30 сек. Для измерений Glc, передача 12 мкл супернатанты в регулярные 96-луночных планшетах. Добавить 192 мкл глюкозооксидазы / пероксидаза (GOPOD) реагента. Инкубируйте пластин при 50 ° С в течение 20 минут и прочитать абсорбции при 510 нм в микропланшетного. Бланк является реакционной смеси без каких-либо фермента. Для XYL измерения, передачи 4 мкл в 384-луночных планшетах. Добавить анализа реактивов и читать пластин при 340 нм. Пустойявляется реакционной смеси без каких-либо фермента. 5. Анализ данных Преобразование значения абсорбции их Glc% и XYL урожайности на основе известных Glc и XYL содержимое исходного биомассы. Импорт эти проценты, как ответы на дизайн-эксперт программного обеспечения. Проверка статистических paramenters быть уверены, что критерии для надежной модели выполнены. Подтвердить лучшую модель предсказания экспериментально. 6. Представитель Результаты с GENPLAT: (1) Создание оптимизированных смесей отдельных чистых белков. Результаты показывают, которых ферменты важны, и в каких пропорциях, а также ферменты, которые не являются важными. Некоторые белки, которые имеются в изобилии в Т. reesei secretome (Nagendran и соавт., 2009), такие как Cip1 и Cip2, как представляется, не играют никакой роли в Glc освобождения из кукурузы Стовер предварительно обработанных аммиаком волокна расширения (AFEX) или щелочных гидравлические Роджен перекись (АХП) (Банерджи и соавт., 2010b). С другой стороны, некоторые белки неожиданно важно. Например, эндо-ксиланазы гликозил семей гидролазы 10 и 11 являются важными для Glc релиз, один ксиланазы не может заменить другие (Банерджи и др., 2010b, с.). Cel61A, незначительных белка в Т. reesei secretome, что очень важно для Glc но не XYL релизе. Некоторые ферменты важны для выпуска как Glc и XYL, тогда как другие необходимы только для одного или другого (Банерджи и соавт., 2010C). Синтетическая смесь, содержащая 16 компонентов, каждый в концентрации 0,94 мг / мл (то есть, не оптимизированной смеси), выпущенный 38% доступных Glc из-AFEX предварительно DDG. При одинаковых условиях гидролиза, оптимизированная смесь, в которой концентрация 16 компонентов в диапазоне от 0% до 32%, выпущенный 52% Glc (рис. 2). Этот эксперимент показывает, утилита построения определена смесей. _content "> (2) Создание оптимизированных для различных коктейлей предварительной обработки / субстрат комбинаций. Текущий коммерческих препаратов целлюлозы являются« один размер подходит всем ". На самом деле, лучший коктейль зависит как от субстрата и предварительной обработки. единого продукта таких как Accellerase 1000 дает различные выходы из различных подложках предварительно таким же образом, и от одной подложке подвергаться различным предварительной обработки (рис. 1). Мы использовали GENPLAT для оптимизации смесей чистые ферменты для нескольких предварительной обработки и Mutiple сырья (Банерджи и др. др.., 2010C). Рисунок 2 показывает, как оптимальные пропорции фермента 16 чистых ферментов отличается для AFEX-предварительно кукурузы Стовер, АХП, предварительно обработанные кукуруза Стовер, и AFEX-предварительно DDG. Только 11 ферментов, показаны на рис. 2, так как оптимальное Пропорции другие пять (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 и Cel12A) оказались 0% (Банерджи и соавт., 2010C). (3) Новый фермент открытие </strОнг>. Строительство оптимизированы смеси чистых белков представляет собой непрерывный процесс. По мере появления новых белков становятся доступными в чистом виде (из коммерческих источников, по гетерологичных выражение, или очищение), они могут быть систематически проверена путем добавления их в текущий оптимизированный набор. Новые белки, которые способствуют или Glc XYL релиз затем стать частью новой, оптимизированный набор. Таким образом, GENPLAT становится платформой для выявления новых ферментов для биомассы деконструкции. Мы сделали экстракты грибов, кроме Т. reesei и А. Нигер, выращенных на различных подложках. Один частности экстракт увеличила Glc выход, когда добавлен в наш основной набор. Ответственность белка очищали и показано, что роман гликозил гидролазы нет в любых коммерческих ферментного препарата (Банерджи и Уолтона, неопубликованные результаты). (4) Открытие лучше ферментов. Показав с GENPLAT которых ферменты являются наиболее важными для деградациичастности биомассы, у нас есть лучшее понимание того, какие ферменты должны быть в центре внимания для улучшения. Лучше примеры критических ферменты могут быть найдены с помощью функции поиска в природе или с помощью белковой инженерии. (Фермент может быть "лучше", чем его Т. reesei гомолога несколькими способами, в зависимости от желаемого имущества, например, более высокую удельную активность, более тесного взаимодействия, снижение протеолитических чувствительности или повышенной термической стабильности). GENPLAT обеспечивает значимые платформой для опробования потенциально лучше ферменты, потому что она использует реально сложный коктейль (не важно, потому что биомасса фермент работает в изоляции) и реалистичной подложки (важно, потому что результаты с чистой целлюлозы или другие искусственные субстраты, не могут иметь отношение к природным лигноцеллюлозных материалов). (5) Коммерческая оптимизация фермента. Достаточно большое количество чистые ферменты еще не существуют в реальном мире. Пока они не делают, про этанолизводителей должны полагаться на коммерческие продукты, такие как Accellerase 1000 и MultifectXylanase. Тем не менее, смесей промышленных ферментов, как правило, выполняют лучше, чем любой человек один, и GENPLAT может быть использована для разработки оптимизированного коктейли из нескольких коммерческих ферментов. На рисунке 3 показано использование GENPLAT оптимизировать смесь четырех коммерческих ферментных препаратов. Оптимальные пропорции для выпуска Glc из-AFEX предварительно DDG были признаны 47% Accellerase1000, 27% Multifect пектиназа, 22% Novozyme 188, и 4% Multifect ксиланазы (Банерджи и соавт., 2010C). Рис 3B показывает различия в Glc выход из AFEX-DDG с четырьмя ферментных препаратов; оптимизированы коммерческих целях смесь дает более высокий урожай, чем Glc Accellerase1000 один, SpezymeCP в одиночку, или 16-компонентов синтетические смеси. Этот эксперимент также показывает, что 16-компонентов синтетических смесь отсутствует один или несколько ферментов, необходимых для оптимального Glc релиз, в котором присутствуют в одной или нескольких коммерческих ферментов. GENPLAT может быть намред идентифицировать такие компоненты. Рисунок 1. Ни один из коммерческих ферментного препарата является оптимальной для всех субстратов и все предварительной обработки. Пять субстратов и три предварительной обработки были сравнены в аналогичных условиях шлифовальных (0,5 мм размером частиц), фермент загрузкой (15 мг / г глюкан), гидролизный условия (48 ч, 50 ° С). А. Переваривание различных AFEX-предварительно субстратов с Accellerase 1000. Б. Пищеварение кукурузы Стовер предварительно обработанные с помощью трех различных методов с Accellerase 1000 (см. Банерджи и соавт., 2010C). Рисунок 2. Оптимальные пропорции 11 ферментов для выпуска Glc из-AFEX предварительно кукурузы Стовер (AFEX-CS), щелочной перекиси водорода, предварительно обработанные кукуруза Стовер (МАИ-CS), или AFEX-предварительно высушенный дистиллироватьERS 'зерна (AFEX-DDG). Данные взяты из Банерджи и соавт. (2010C). Номера в верхней части бары Glc дает в процентах от общего Glc в биомассе образца. Рисунок 3. A. Использование GENPLAT производить оптимизированные смеси из четырех коммерческих ферментных препаратов для выпуска Glc из-AFEX предварительно DDG. Multifect ксиланазы сделали наименьший вклад (4%) и поэтому исключены из этой тройной диаграмме. Б. Glc урожайности AFEX-DDG с различными лечения фермента при одинаковых условиях гидролиза (15 мг / г глюкан фермента, 48 ч, 50 ° С) . "Четыре-компонента коммерческих" имеет пропорции определяются из эксперимента приведена на рис. 3А.

Discussion

Широко признано, что снижение стоимости ферментов важно развитие экономических лигноцеллюлозных промышленность этанола. В настоящее время доступны коммерческие коктейли фермента являются сложными и плохо определены смеси многих белков (Nagendran и соавт., 2009), и они приспособлены в основном для использования на кислотно-предварительно кукурузы Стовер. В целях ускорения разработки более совершенных коктейлей фермент, несколько лабораторий разработали высокой пропускной способности платформ для открытия ферментов и характеристики. Усилия в этой области, включили один или несколько из следующих свойств также в GENPLAT: робот дозирования ферментов и биомассы суспензий, статистический дизайн эксперимента, и / или автоматизированных определения Glc и XYL (Берлин и др., 2007; Decker и др.. др., 2009;. Ким и др., 1998;. Король и др., 2009).. GENPLAT расширяет эти более ранние усилия, что наиболее важно в сложности ферментом смеси, которые могут быть проанализированы с не более 6 компонентов вболее ранние исследования в более чем 16 в нашу последнюю работу (Банерджи и соавт., 2010C). Дополнительные ключевые особенности GENPLAT являются использование бусинка смесительной камеры (лопасть водохранилище), которые могут держать Стовер шламов приостановлены во время отпуска; нежный смешивания в процессе пищеварения до конца по сравнению с аналогичным конце вращения; и автоматизированных колориметрических определения Glu и XYL.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)