GENPLAT : 바이오 매스의 효소 발견과 칵테일 최적화를위한 자동 플랫폼

Summary

GENPLAT (GLBRC 효소 플랫폼)는 바이오 매스 열화에 대한 효소 칵테일의 발견과 최적화를위한 자동화 플랫폼입니다. 이것은 여러 feedstocks 및 여러 구성 요소를 포함하는 효소의 혼합물에 적용할 수 있습니다.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. 효소 생산 벡터 pPICZ 또는 pPICZα에 해당 유전자의 복제와 P.으로 변환하여 Pichia pastoris에의 단백질을 생산 pastoris. 메탄올 유도와 함께 실패하는 500 ML flasks 300 – ML 배치에서 세포를 성장마다 24 시간 (Banerjee 외., 2010a). 집중과 접선 흐름 여과하여 문화 filtrates을 탈염하다. -80에서 20 % 글리세롤의 작은 aliquots에있는 효소를 저장 ° C. 농도 범위는 MG / ML 10-10입니다. 2. 실험의 설계 입력 테스트하는 효소의 수를 그들의 위턱과 아래턱 비율 (핵심 효소 5 %의 낮은 비율을 예), 그리고 디자인 Expertsoftware으로 실험 설계 (예 : 차 또는 입방)의 유형입니다. 15 MG / G 글루칸 총 로딩을 추가할 수 각 효소 μg에 금액을 계산하고 다음에 추가 μl 각 효소의 양을 계산각각의 반응. 실험 설계 및 Biomek FXP 소프트웨어로 가져오기를 전송 -에서 – 파일 함수를 사용에 따라 물, 효소의 분배에 대한 소스 labware, 소스 우물, 대상 labware, 대상 우물, 그리고 전송 볼륨을 지정 Excel 워크시트를 생성합니다. 3. 효소 가수 분해 패들 저수지에서 5 μg / ML의 테트라 사이클린과 5 μg / ML cycloheximide를 포함, 50 MM 나트륨 구연산, 산도 4.8의 바이오 매스 슬러리를 일시 중지합니다. 96 – 웰 깊은 잘 반응 플레이트의 각 우물에 슬러리의 Robotically pipet 200 μl는 스팬 – 8로 잘라 마지막 0.5 cm로 1000 μl pipet 도움말을 사용합니다. 100 μl / 초 한 번에 슬러리를 혼합하고 패들 저수지에서 동일한 볼륨을 기음하고 접시에 분배. 베크 만 FX에 입력된 프로그램을 사용하여 동일한 접시에 효소를 분배. pierceable capmats로 번호판을 밀봉합니다. 반전과 탭접시는 몇 시간은 표면 장력을 극복하기. 10 RPM의 회전 하이브 리다이 제이션 인큐베이터에서 48 시간 50 ° C에서 접시를 놓습니다. 4. Glc 및 Xyl의 결정 스윙 버킷 원심 분리기의 1,250 XG에서 3 분 반응 번호판을 원심 분리기. Biomek FX의 AP96 포드를 사용하여 정기적으로 96 – 웰 플레이트로 뜨는 100 μl을 전송합니다. 90-95시 번호판을 품어 ° C 효소를 inactivate 후 30 초에 대한 1,250 XG에서 원심을 위해 10 분. Glc 측정, 일반 96 – 웰 플레이트에 supernatants 12 μl를 전송합니다. 포도당 산화 효소 / 퍼옥시데이즈 (GOPOD) 시약의 192 μl를 추가합니다. 20 분 50 ° C에서 접시를 부화하고 microplate 리더에서 510 nm의에서 absorbances를 참조하십시오. 공백없이 효소와 반응 혼합물이다. Xyl 측정, 384 잘 접시에 4 μl를 전송합니다. 분석 시약을 추가하고 340 nm의에서 접시를 참조하십시오. 공백없이 효소와 반응 혼합물이다. 5. 데이터 분석 알려진 Glc하고 원래 바이오 매스의 Xyl 내용에 따라 자신의 % Glc 및 Xyl의 수율로 흡광도 값을 변환합니다. 답변으로 디자인 전문 소프트웨어로 이러한 비율을 가져옵니다. 강력한 모델에 대한 기준이 충족되어 있는지 확인하는 통계 paramenters를 확인합니다. 실험적으로 최고의 모델 예측을 확인합니다. 6. GENPLAT와 대표 검색 결과 : (1) 개인 순수한 단백질의 최적화된 혼합물의 창조. 결과는 효소가 중요있는 표시, 그리고 어떤 비율로, 또한 어떤 효소는 중요하지 않습니다. T. 풍부 일부 단백질 이러한 Cip1 및 Cip2로 reesei secretome은 (Nagendran 외., 2009), 암모니아 섬유 확장 (AFEX) 또는 알칼리 hyd에 의해 pretreated 옥수수 여물에서 Glc 릴리스에 역할을하지 나타납니다 로겐, 과산화수소 (AHP) (Banerjee 외., 2010b). 반면에, 일부 단백질이 예기치 않게 중요합니다. 예를 들어, Glycosyl 하이드 롤 레이스 가족 10 11 엔도 – xylanases는 Glc 릴리스 모두 중요하다, 한 xylanase이 다른 (. Banerjee 외, 2010b, C)를 대신할 수 없습니다. Cel61A, T.의 사소한 단백질 reesei secretome 아주 Glc 중요하지만 릴리스 Xyl되지 않습니다. 다른 하나 또는 다른 (Banerjee 외., 2010c)에 필요한 반면 일부 효소는 Glc 및 Xyl 모두 릴리스 중요합니다. 0.94 MG / ML (즉, 비 최적화된 혼합물)의 농도 16 구성 요소 각각을 포함하는 합성 혼합은 AFEX – pretreated DDG에서 사용할 수있는 Glc의 38 %를 발표했다. 동일한 가수 분해 조건 하에서 최적의 혼합이되는 16 구성 요소의 농도가 0퍼센트에서 32 %로였다 (그림 2) Glc의 52 %를 발표했다. 이 실험은 정의 혼합 건설의 유틸리티를 보여줍니다. _content "다른 전처리 / 기판 조합에 최적화된 칵테일> (2) 창조. 현재 상업 cellulase의 준비은"한 – 크기 – 맞는 – 모든 ". 현실에서 최고의 칵테일은 기판과 전처리 모두에 따라 달라집니다. 하나의 제품 Accellerase 1000 같은 방법으로 pretreated 다양한 기판에서 서로 다른 pretreatments (그림 1)에 노출 동일한 기판 다른 수율을 제공 등. 우리는 여러 pretreatments 및 mutiple feedstocks (Banerjee 동부 표준시에 대한 순수한 효소의 혼합물을 최적화하는 GENPLAT를 사용했습니다 알., 2010c). 그림 2는 16 순수한 효소의 최적 효소 비율이 AFEX – pretreated 옥수수 여물, AHP – pretreated 옥수수 여물, 그리고 AFEX – pretreated DDG에 대한 다른 방법을 보여줍니다. 단 11 효소가 그림에 표시됩니다. 2 최적의 이유 나머지 다섯 (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2, 그리고 Cel12A)의 비율은 (Banerjee 외., 2010c) 0 %가된다는 것을 발견했다. (3) 소설 효소 발견 </str긴 사연이>. 순수한 단백질의 최적화된 혼합물의 건설 진행 과정입니다. 새로운 단백질은 순수 양식 (상용 소스에서 heterologous 표현에 의해, 또는 정화하여)에서 사용할 수 해짐에 따라, 그들은 체계적으로 현재 최적화된 설정을 추가하여 테스트할 수 있습니다. Glc 또는 Xyl에 기여하는 새로운 단백질이 새, 최적화된 집합의 일부가 공개. 이러한 방법으로 GENPLAT는 바이오 매스 해체에 대한 새로운 효소의 식별을위한 플랫폼이된다. 우리는 T. 이외 버섯의 추출물을 만들었습니다 reesei와 A. 니제르는 다른 기판에 성장. 핵심 세트에 추가하면 하나의 특정 추출물 Glc 수율이 없어졌다. 책임 단백질은 정제과 (Banerjee와 월튼, 발표되지 않은 결과) 상업적 효소 준비에 존재하지 않는 소설 glycosyl 하이드 롤 레이스로 표시되었다. 더 효소 (4) 발견. 의 저하에 대한 효소가 가장 중요 GENPLAT로 표시하는 데특히 바이오 매스, 우리는 효소가 개선 초점되어야하는 더 나은 이해를했습니다. 중요한 효소의 더 나은 예는 자연에서 검색하여 발견되거나 단백질 공학에 의해 만들 수 있습니다. (효소가 원하는 속성에 따라 여러 가지 방법으로 자사의 T. reesei의 상동체보다 "더"가 될 수있다, 예를 들어, 높은 특정 활동, 큰 시너지 효과는 proteolytic 감도, 또는 향상된 열적 안정성을 감소). 순수한 셀룰로스 또는 기타 인공 기판과 결과는 자연 리그노셀룰로오스성에 관련되지 않을 수 있기 때문에 그것이 현실 복잡한 칵테일 (아무 바이오 매스 효소가 격리 작동하지 않기 때문에 중요한) 중요한 현실적인 기판 (활용하기 때문에 GENPLAT는 잠재적으로 더 효소를 시금위한 의미있는 플랫폼을 제공합니다 자료). (5) 상업 효소 최적화. 순수한 효소의 충분히 많은 양의 아직 현실 세계에서 존재하지 않습니다. 그들이 때까지 에탄올 프로ducers는 Accellerase 1000 MultifectXylanase와 같은 상용 제품에 의존해야합니다. 단, 상업 효소의 혼합물은 일반적으로 개인보다 더 나은 수행하고, GENPLAT은 여러 상업 효소의 최적 칵테일을 디자인하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 3 네 상업 효소 준비의 혼합물을 최적화할 수 GENPLAT의 사용을 보여줍니다. AFEX – pretreated DDG에서 Glc의 릴리스에 대한 최적의 비율은 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, 그리고 4퍼센트 Multifect Xylanase (Banerjee 외., 2010c)으로 발견되었다. 그림 3B 네 효소 준비와 AFEX – DDG에서 Glc 수율의 차이를 보여줍니다, 최적화된 상업 혼합물은 높은 Glc 수율을 제공 혼자 Accellerase1000보다 SpezymeCP 혼자, 또는 16 요소 합성 혼합물. 이 실험은 또한 16 구성 요소 합성 혼합물은 상업 효소 중 하나 이상에 존재하는 최적의 Glc 릴리스에 필요한 하나 이상의 효소가없는 것을 나타냅니다. GENPLAT 우리 수에드는 구성 요소를 식별합니다. 그림 1. 하나가 상업 효소 준비는 모든 기판 모든 pretreatments 최적 않습니다. 다섯 기판 세 pretreatments은 (0.5 mm 입자 크기) 연삭 비슷한 조건 하에서 비교했다, 효소로드 (15 MG / G 글루칸) 및 가수 분해 조건 (48 시간, 50 ° C) 다른 AFEX – pretreated 기판. A.의 소화 Accellerase 1000 '와. 옥수수 여물의 B.는 소화 Accellerase 1000'와 세 가지 방법 (Banerjee 외를 참조하십시오., 2010c)에 의해 pretreated. 그림 2. AFEX – pretreated 옥수수 여물 (AFEX – CS), 알칼리 수소 과산화물 – pretreated 옥수수 여물 (AHP – CS) 또는 말린 AFEX – pretreated에서 Glc의 릴리스 11 효소의 최적 비율은 증류ERS '곡식 (AFEX – DDG). 데이터 Banerjee 외에서 있습니다. (2010c). 막대의 상단 숫자는 바이오 매스 샘플의 총 Glc의 비율로 Glc의 산출됩니다. 그림 3. A. AFEX – pretreated DDG에서 Glc의 릴리스에 대한 네 상업 효소 준비의 최적 혼합을 생산 GENPLAT의 사용합니다. Multifect Xylanase의 작은 기여 (4 %)를 만들어 그러므로이 3 원 그림에서 생략되었습니다. 동일한 가수 분해 조건 (15 MG / G 글루칸 효소, 48 H, 50 ° C)에 따라 서로 다른 효소 치료를 AFEX – DDG에서 B. Glc의 수확량이 . "4 – 구성 요소 상업은"그림에 표시된 실험에서 결정된 비율을했다. 3A.

Discussion

그것은 널리 효소의 비용을 절감하는 경제적인 리그노셀룰로오스성 에탄올 산업의 발전에 중요하다는 인식됩니다. 현재 사용 가능한 상용 효소 칵테일은 여​​러 단백질 (Nagendran 외., 2009)의 복잡하고 제대로 정의 혼합물이며, 그들은 주로 산성 – pretreated 옥수수 여물에 사용에 대한 적응입니다. 더 효소 칵테일의 발전을 촉진하기 위해서는 여러 실험실 효소 발견과 특성화에 대한 높은 처리량 플랫폼을 개발했습니다. .; 데커 동부 표준시 로봇 효소 및 바이오 매스 slurries의 분배, 실험의 통계적 설계, 및 / 또는 Glc의 자동 결정 및 Xyl (베를린 외, 2007 :이 영역에서 노력도 GENPLAT에서 찾은 다음 속성 중 하나 이상을 포함해야 알 2009;. 김 외, 1998;. 킹 외, 2009).. GENPLAT는 대부분 6 구성 요소에서 분석할 수있는 효소 혼합물의 복잡 가장 크게, 이러한 이전의 노력을 확장최근 작품 이상의 16 이전 연구 (Banerjee 외., 2010c). 완만한​​은 엔드 오버 엔드 회전에 의해 소화하는 동안 믹싱, 및 GLU와 Xyl의 자동 colorimetric 결정 GENPLAT의 추가 주요 기능은 분배하는 동안 정지 여물의 slurries을 유지할 수 있습니다 비드 혼합 챔버 사용 (패들 저수지)입니다.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)