GENPLAT：バイオマスの酵素の発見とカクテルの最適化のための自動化プラットフォーム

Summary

GENPLAT（GLBRC酵素のプラットフォーム）は、バイオマスの分解のための酵素カクテルの発見と最適化のための自動化されたプラットフォームです。それは、複数のコンポーネントが含まれている酵素の複数の原料と混合物に適合させることができます。

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1。酵素の生産ベクトルpPICZまたはpPICZαに対応する遺伝子のクローニングとP.への変換によるピキアパストリス中のタンパク質を生成するピキアパストリス 。メタノール誘導でバッフル付500mlのフラスコに300mlのバッチで細胞を成長させる毎に24時間（バネルジーら、2010A）。 タンジェンシャルフロー濾過により培養濾液を濃縮し、脱塩。 -80 20％グリセロールで小分けに酵素℃にて保存してください。濃度範囲は1〜10 mg / mlのです。 2。実験の設計入力テストする酵素の数は、その上部と下部の比率（コア酵素は5％の低い割合など）、およびデザインExpertsoftwareに実験的なデザイン（例えば、二次または三次）のタイプ。 の15 mg / gのグルカンの合計負荷を作るに追加する各酵素のμg単位の量を計算し、に追加するμlで各酵素の量を計算するそれぞれの反応。 実験的なデザインと分注FXPのソフトウェアにインポートして転送元ファイルの関数を使用してに応じて水と酵素の分注のためにソースの実験器具、ソースの井戸、先の実験器具、先の井戸、および移動量を指定してExcelワークシートを生成します。 3。酵素加水分解パドルの貯水池で、5μg/ mlのテトラサイクリン、5μg/ mlのシクロヘキシミドを含む、50mMのクエン酸ナトリウム、pHを4.8にバイオマスのスラリーを一時停止します。 スパン- 8カットオフ最後の0.5センチメートル1000 -μLピペットチップを用いて96ウェルディープウェル反応プレートの各ウェルにスラリーのロボット制御でピペットを200μl。を100μl/秒に一度スラリーを混合してから、パドルの貯水池から同じボリュームを吸引し、プレートに分注する。 ベックマンFXに入力されたプログラムを使用して、同じプレートに酵素を分注する。 貫​​通capmatsでプレートをシール。 逆さにしてタッププレート表面張力を克服するために数回。 10rpmでハイブリダイゼーションインキュベーター回転で48時間、50℃でプレートを置きます。 4。グルコースとXYLの決定スイングバケット遠心機で1250 × gで3分間反応プレートを遠心する。 分注FXのAP96ポッドを使用して、通常の96ウェルプレートに上清100μlを移す。 90から95でプレートをインキュベート℃で10分間の酵素を不活性化し、30秒、1250 × gで遠心分離するために。 グルコースの測定では、定期的な96ウェルプレートに上清12μlを移す。グルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ（GOPOD）試薬192μlを添加する。 20分間50℃で培養すると、マイクロプレートリーダーで510 nmで吸光度を読み取る。ブランクは、酵素なしで反応混合物です。 XYL測定では、384ウェルプレートに4μlを移す。アッセイ試薬を追加し、340nmでプレートを読み取る。空酵素なしで反応混合物です。 5。データ解析既知のグルコースと、元のバイオマスのXYL内容に基づいて％グルコースとXYLの収量に吸光度の値を変換します。デザインエキスパートソフトウェアへの応答として、これらのパーセンテージをインポートします。堅牢なモデルのための基準が満たされていることを確認するために統計的paramentersを確認してください。 実験的に最適なモデルの予測を確認してください。 6。 GENPLATと代表的な結果： （1）個々の純粋なタンパク質の最適化された混合物の作成 ​​。結果は、酵素が重要であるかを示し、そしてどのような割合で、そしてまたその酵素は重要ではありません 。 T.に豊富に存在するいくつかのタンパク質このようなCIP1とCIP2としてトリコデルマリーセイ secretome（Nagendranら、2009）、、アンモニア繊維の拡大（AFEX）またはアルカリ俵で前処理したトウモロコシの茎葉からグルコースのリリースでは何の役割も果たさないように見えるロゲンの過酸化水素（AHP）（バネルジーら、2010B）。一方、いくつかのタンパク質が突然重要です。例えば、糖加水分解酵素ファミリー10と11のエンド – キシラナーゼはGlcのリリースの両方が重要であり、一つキシラナーゼは、他の（。バネルジーら、2010B、C）のために代用することはできません。 Cel61A、T.のマイナータンパク質XYLのリリースでは、 トリコデルマリーセイ secretomeを、グルコースは非常に重要ですが、ではない。他の人がどちらか一方だけ（バネルジーら、2010C）のために必要であるのに対し、いくつかの酵素は、グルコースとXYLの両方のリリースのために重要である。 16成分、0.94 mg / mlの（すなわち、最適化されていない混合物）の濃度で各々を含有する合成混合物は、AFEX前処理DDGから利用可能なグルコースの38％を発表した。同一の加水分解条件下では、最適化された混合物は、これで16成分の濃度は、0％から32％であった（図2）グルコースの52％を発表した。この実験では、定義された混合物を構築するユーティリティを示しています。 "万能サイズ">（2）別の前処理/基板の組み合わせに最適化されたカクテルの作成 ​​。現在の商業セルラーゼの準備がある"_content。現実には、最高のカクテルは、基板と前処理の両方に依存する。単一製品Accellerase 1000と同じ方法で前処理した別の基板から別の収量を与え、別の前処理（図1）に公開されている同じ基板からそのように我々は、複数の前処理とみとめ原料（バネルジーらのために純粋な酵素の混合物を最適化するためにGENPLAT使用しているら、2010C）。図2は、16純粋な酵素の最適な酵素比率がAFEX前処理トウモロコシの茎葉、AHP -前処理トウモロコシの茎葉、およびAFEX前処理DDGの違いを示しています。わずか11酵素を図2に示されているの最適な理由他の五（Cel61B、AbfB、CIP1、CIP2、およびCel12A）の割合は0％（バネルジーら、2010C）であることがわかった。 （3）新規酵素の発見 </strオング>。純粋なタンパク質の最適化された混合物の建設は継続的なプロセスです。新しいタンパク質は（商業的供給源から、異種発現によって、または精製して）純粋な形で利用できるようになると、それらは体系的に現在最適化されたセットに追加してテストすることができます。グルコースまたはXYLに寄与する新規タンパク質は、新しい、最適化されたセットの一部となってから離します。このように、GENPLATはバイオマスの脱構築のための新しい酵素を同定するためのプラットフォームになります。我々は、T.以外の菌の抽出を行っているデルマリーセイおよびA.ニジェールでは、異なる基板上に成長した。私たちのコアセットに追加したとき、ある特定の抽出は、グルコース収率を後押しした。責任あるタンパク質を精製し、（Banerjeeさんとウォルトン、未発表結果）任意の市販の酵素調製物中に存在する新規なグリコシル加水分解酵素であることが示された。 よりよい酵素の（4）発見 。の劣化のための酵素が最も重要であるGENPLATで表示した特にバイオマスは、私たちは酵素が改善のための焦点でなければならないそのうちのよりよい理解を持っている。重要な酵素の良い例は、自然の中で検索して見つけるか、タンパク質工学によって作ることができる。 （酵素は、所望の特性に応じて、いくつかの方法でそのT.デルマリーセイのホモログ、より"良い"かもしれない、例えば、より高い比活性、より大きな相乗効果は、タンパク質分解感受性、または強化された熱安定性を減少させた）。純粋なセルロースまたは他の人工的な基質との結果が自然リグノセルロースに該当しない場合がありますので、それは現実的に複雑なカクテル（重要ではバイオマスの酵素は、単独で動作しないため）と現実的な基板（重要を使用しているためGENPLATは、潜在的に優れた酵素をアッセイするために意味のあるプラットフォームを提供します。材料）。 （5）市販の酵素の最適化 。純粋な酵素の十分に大きな量はまだ現実の世界には存在しません。彼らが実行するまで、エタノールプロducersなどAccellerase 1000 MultifectXylanaseとして商用製品に依存する必要があります。しかし、市販酵素の混合物は一般に、個々のものよりパフォーマンスに優れ、そしてGENPLATは、複数の市販酵素の最適化されたカクテルを設計するために使用することができます。図3は、4つの市販の酵素製剤の混合物を最適化するためにGENPLATの使用方法を示します。 AFEX前処理DDGからGlcのリリースのための最適な割合は47％Accellerase1000、27％Multifectペクチナーゼ、22％Novozyme 188、および4％Multifectキシラナーゼ（バネルジーら、2010C）であることがわかった。図3Bは、4つの酵素製剤とAFEX – DDGからグルコース収率の違いを示しています。最適化された商業用混合物は、高グルコースの収率が得られるだけでAccellerase1000より、SpezymeCP単独で、または16ビットコンポーネントの合成混合物。この実験はまた、16成分合成混合物は、市販酵素の一つ以上に存在する最適なグルコース放出、のために必要な1つ以上の酵素が欠けていることを示しています。 GENPLATは、私たちすることができますそのようなコンポーネントを識別するためにED。 図1は、単一の市販の酵素調製物は、すべての基板と、すべての前処理に最適なです 。五基板三前処理は、（0.5 mmの粒径）研削の同様の条件下で比較した、酵素負荷（15 mg / gのグルカン）、および加水分解の条件（48時間、50 ° C）異なるAFEX前処理基板の。A.消化 Accellerase 1000で。トウモロコシの茎葉のB.の消化Accellerase 1000で3つの異なる方法（Banerjeeさんらを参照してください。、2010C）で前処理する。 図2。AFEX前処理トウモロコシの茎葉（AFEX – CS）、アルカリ性過酸化水素前処理トウモロコシの茎葉（AHP – CS）、またはAFEX前処理乾燥は蒸留からのグルコースの放出のための11の酵素の最適な比率ERS"穀物（AFEX – DDG）。データは、バネルジーらからです。 （2010C）。バーの上部にある数字は、バイオマス試料中の全Glcのパーセントとしてグルコースの収量です。 図3。A. AFEX前処理DDGからGlcのリリースの4つの市販の酵素製剤の最適化された混合物を生成するためにGENPLATの使用。 Multifectキシラナーゼは、最小の貢献（4％）したため、この三角図から省略した。B.グルコースの収率は、同一の加水分解条件下での異なる酵素処理（15 mg / gのグルカンの酵素、48時間、50℃）でAFEX – DDGから。 "四成分の商業は、"図に示すように実験から決定されたプロポーションを持っています。 3A。

Discussion

これは、広く酵素のコストを削減することが経済的なリグノセルロースエタノール産業の発展にとって重要であることが認識されている。現在入手可能な市販の酵素カクテルは、多くのタンパク質（Nagendranら、2009）の複雑で不完全に定義された混合物であり、これらは主に酸で前処理トウモロコシの茎葉上での使用に適合している。優れた酵素カクテルの開発を加速するためには、いくつかの研究室では、酵素の発見と特性評価のためのハイスループットプラットフォームを開発しました。 。。デッカーらロボットの酵素とバイオマススラリーの調剤、実験の統計的設計、および/またはグルコースの自動測定とXYL（ベルリンら、2007：この地域での取り組みもGENPLATで見つかった次のプロパティの一つ以上を組み込んでいますら、2009;。Kimら、1998;。キングら、2009）。。 GENPLATはに最大で6つのコンポーネントから分析することができる酵素の混合物の複雑さで最も大きく、これらの以前の取り組みを拡張する私たちの最新作で16個以上の初期の研究（バネルジーら、2010C）。穏やかに転倒回転による消化中に混合;とGluとXYLの自動比色定量GENPLATのその他の主要機能は、調剤中に中断された茎葉のスラリーを保つことができるビーズ混合室の使用（パドルの貯水池）です。

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)