GENPLAT: una piattaforma automatizzata per la scoperta degli enzimi biomassa e ottimizzazione Cocktail

Summary

GENPLAT (Enzyme GLBRC Platform) è una piattaforma automatizzata per la scoperta e l'ottimizzazione di cocktail di enzimi per la degradazione della biomassa. Può essere adattato alle materie prime più e miscele di enzimi contenenti più componenti.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. Enzima di produzione Producono proteine ​​in Pichia pastoris per la clonazione dei geni corrispondenti in vettori pPICZ o pPICZα e la trasformazione in P. pastoris. Crescere le cellule in lotti da 300 ml in sconcertato da 500 ml palloni con induzione metanolo ogni 24 ore (Banerjee et al. 2010a). Concentrato e desalt i filtrati dalla cultura filtrazione a flusso tangenziale. Conservare gli enzimi in piccole aliquote nel 20% glicerolo a -80 ° C. L'intervallo di concentrazione è 1-10 mg / ml. 2. Progettazione di Experiment Inserire il numero di enzimi da testare, i loro superiori e inferiori proporzioni (ad esempio una percentuale inferiore al 5% per gli enzimi core), e il tipo di disegno sperimentale (ad esempio, quadratica o cubica) nella progettazione Expertsoftware. Calcolare la quantità in mg di ciascun enzima da aggiungere per fare un carico totale di 15 mg / g di glucano, e quindi calcolare la quantità di ciascun enzima in microlitri da aggiungere allaogni reazione. Generare fogli di lavoro Excel specificando da laboratorio sorgente, pozzi fonte, da laboratorio di destinazione, pozzi di destinazione e dei volumi di trasferimento per l'erogazione di acqua ed enzimi secondo il disegno sperimentale e importarlo nel software Biomek FXP utilizzando il trasferimento di file funzione. 3. Idrolisi enzimatica Sospendere il liquame biomassa in 50 mM di sodio citrato, pH 4.8, contenente 5 mg / ml di tetraciclina e 5 mg / ml cicloeximide, nel serbatoio pagaia. Roboticamente pipetta 200 ul del liquame in ciascun pozzetto di un pozzo profondo 96-pozzetti di reazione mediante Span-8 1000-microlitri puntali con gli ultimi 0,5 centimetri tagliato. Mescolare l'impasto una volta a 100 l / sec e quindi aspirare lo stesso volume dal serbatoio pagaia e distribuire nei piatti. Erogare gli enzimi nella piastra stessa utilizzando il programma inserito nel FX Beckman. Sigillare le piastre con capmats perforabile. Inverti e toccarele piastre più volte di superare la tensione superficiale. Posizionare le piastre a 50 ° C per 48 ore nella ibridazione rotazione incubatore a 10 giri. 4. Determinazione del Glc e Xyl Centrifugare le piastre di reazione per 3 min a 1250 xg in una centrifuga secchio oscillante. Trasferire 100 ml di surnatante in regolare piastre con 96 pozzetti utilizzando l'AP96 pod della Biomek FX. Incubare le piastre a 90-95 ° C per 10 minuti per inattivare gli enzimi, quindi si centrifuga a 1250 xg per 30 sec. Per le misure Glc, trasferire 12 microlitri della surnatanti in regolare piastre a 96 pozzetti. Aggiungere 192 microlitri della ossidasi / perossidasi del glucosio (goPod) reagente. Incubare le piastre a 50 ° C per 20 minuti e leggere le assorbanze a 510 nm in un lettore di micropiastre. Blank è miscela di reazione senza enzima. Per le misure Xyl, trasferimento 4 microlitri in piastre da 384 pozzetti. Aggiungere i reagenti e leggere le piastre a 340 nm. Vuotoè la miscela di reazione senza enzima. 5. Analisi dei dati Convertire i valori di assorbanza% Glc loro e rese Xyl basato sul noto Glc e contenuti Xyl della biomassa originale. Importare queste percentuali delle risposte in Design-Expert. Controllare la paramenters statistiche per essere sicuri che i criteri per un robusto modello sono soddisfatte. Confermare la previsione miglior modello sperimentale. 6. Risultati rappresentante con GENPLAT: (1) La creazione di miscele ottimizzata di singole proteine ​​pure. I risultati indicano che gli enzimi sono importanti, e in quali proporzioni, e anche che gli enzimi non sono importanti. Alcune proteine ​​che sono abbondanti nel T. reesei secretome (Nagendran et al., 2009), come Cip1 e Cip2, sembrano svolgere alcun ruolo nel Glc comunicato dal mais pretrattati con espansione in fibra di ammoniaca (AFEX) o alcaline hyd Stover Rogen perossido (AHP) (Banerjee et al. 2010b). D'altra parte, alcune proteine ​​sono inaspettatamente importanti. Per esempio, endo-xilanasi delle famiglie glicosil idrolasi 10 e 11 sono entrambi importanti per Glc rilascio, uno xilanasi non può sostituire l'altro (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, una proteina minore del T. reesei secretome, è molto importante per Glc ma non Xyl rilascio. Alcuni enzimi sono importanti per il rilascio di entrambi i Glc e Xyl, mentre altri sono necessarie solo per una o l'altra (Banerjee et al. 2010C). Una miscela di sintesi contenente 16 componenti, ciascuna ad una concentrazione di 0,94 mg / ml (cioè un non ottimizzato miscela), rilasciata il 38% dei disponibili Glc da AFEX pre-trattati con DDG. In condizioni di idrolisi identiche, una miscela ottimizzata, in cui le concentrazioni dei 16 componenti varia da 0% al 32%, rilasciata il 52% del Glc (Fig. 2). Questo esperimento illustra l'utilità della costruzione di miscele definite. _content "> (2) La creazione di cocktail ottimizzata per il pretrattamento diversi / combinazioni substrato. attuali preparazioni cellulasi commerciali sono" one-size-fits-all ". In realtà, i migliori cocktail dipende sia dal substrato e il pretrattamento. Un unico prodotto come Accellerase 1000 dà rese diverse da diversi substrati pretrattati allo stesso modo, e dal substrato stesso esposto a pretrattamenti (Fig. 1). Abbiamo usato GENPLAT per ottimizzare le miscele di enzimi per puro pre-trattamenti multipli e materie prime mutiple (Banerjee et al. 2010C). Figura 2 mostra come le proporzioni degli enzimi ottimale di 16 enzimi puro si distingue per paglia del mais AFEX-pretrattati, AHP-pretrattati paglia del mais, e AFEX pre-trattati con DDG. Solo 11 gli enzimi sono mostrati in fig. 2 perché l'ottimale proporzioni degli altri cinque (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 e Cel12A) sono risultate pari a 0% (Banerjee et al. 2010C). (3) Novel scoperta degli enzimi </strong>. La costruzione di miscele ottimizzata di proteine ​​pure è un processo continuo. Come si rendono disponibili nuove proteine ​​in forma pura (di origine commerciale, di espressione eterologa, o purificazione), possono essere sistematicamente testati aggiungendoli al set corrente ottimizzato. Nuove proteine ​​che contribuiscono a Glc o Xyl rilasciare poi diventare parte di una nuova serie ottimizzata. In questo modo, GENPLAT diventa una piattaforma per l'identificazione di nuovi enzimi per la decostruzione della biomassa. Abbiamo fatto di estratti di funghi diverso da T. reesei e A. niger cresciuti su diversi substrati. Un estratto di particolare potenziato resa Glc quando aggiunto al nostro set base. La proteina responsabile era purificata e dimostrato di essere un romanzo glicosil idrolasi non presente in alcun preparato enzimatico commerciale (Banerjee e Walton, risultati non pubblicati). (4) La scoperta di una migliore enzimi. Dopo aver dimostrato con GENPLAT che gli enzimi sono più importanti per la degradazione di unparticolare la biomassa, abbiamo una migliore comprensione di enzimi che dovrebbe essere l'obiettivo di miglioramento. Esempi migliori degli enzimi critica potrebbe essere quella di cercare in natura o resi mediante ingegneria proteica. (Un enzima potrebbe essere "migliore" rispetto al suo omologo T. reesei in diversi modi, a seconda della proprietà desiderata, ad esempio, l'attività più specifiche, una maggiore sinergia, diminuita sensibilità proteolitici, o maggiore stabilità termica). GENPLAT fornisce una piattaforma significativa per saggiare gli enzimi potenzialmente migliore, perché utilizza un cocktail realisticamente complessi (importante perché nessuna enzima biomassa lavora in isolamento) e un substrato realistico (importante perché i risultati con pura cellulosa o altri substrati artificiali non possono essere rilevanti per lignocellulosici naturali materiali). (5) ottimizzazione enzima commerciale. Quantità sufficientemente grande di enzimi puri non esistono ancora nel mondo reale. Finché non lo farà, l'etanolo proproduttori devono fare affidamento su prodotti commerciali come Accellerase 1000 e MultifectXylanase. Tuttavia, miscele di enzimi commerciali in genere un rendimento migliore rispetto a qualsiasi individuo, e GENPLAT può essere usato per progettare cocktail ottimizzato di più enzimi commerciale. La figura 3 mostra l'uso di GENPLAT per ottimizzare una miscela di quattro preparati enzimatici commerciali. Le proporzioni ottimali per il rilascio di Glc da AFEX pre-trattati con DDG sono risultate essere il 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinasi, 22% Novozyme 188, e il 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al. 2010C). Figura 3B mostra le differenze di rendimento Glc da AFEX-DDG con quattro preparati enzimatici, la miscela ottimizzata commerciale dà maggiore rendimento rispetto Glc Accellerase1000 solo, SpezymeCP da solo, o un 16-componente miscela sintetica. Questo esperimento indica anche che l'16-componente miscela sintetica non è presente uno o più enzimi necessari per il rilascio ottimale Glc, che sono presenti in uno o più degli enzimi commerciale. GENPLAT ci può essereed per identificare i componenti del genere. Figura 1. Nessuna preparazione singolo enzima commerciale è ottimale per tutti i sottofondi e tutti i pre-trattamenti. Cinque substrati e tre pre-trattamenti sono stati confrontati in condizioni simili di macinazione (0,5 granulometria mm), enzima di carico (15 mg / g glucani), e le condizioni di idrolisi (48 ore, 50 ° C). A. digestione di diverse AFEX-substrati pretrattati con Accellerase 1000. Digestione B. di paglia del mais pretrattati con tre metodi diversi con Accellerase 1000 (vedi Banerjee et al. 2010C). Figura 2. Proporzione ottimale di 11 enzimi per il rilascio del Glc da AFEX-pretrattati paglia del mais (AFEX-CS), perossido di idrogeno alcalino-pretrattati paglia del mais (AHP-CS), o AFEX-pretrattati secca distillaregrani ERS '(AFEX-DDG). I dati sono da Banerjee et al. (2010C). Numeri lungo la parte superiore delle barre sono le rese Glc come percentuale del totale Glc nel campione biomassa. Figura 3. A. L'uso di GENPLAT per produrre una miscela ottimizzata di quattro preparati enzimatici commerciali per il rilascio di Glc da AFEX pre-trattati con DDG. Multifect Xylanase fatto il più piccolo contributo (4%) ed è stato quindi omesso da questo diagramma ternario. B. rendimenti Glc da AFEX-DDG con trattamenti enzimatici diversi idrolisi in condizioni identiche (15 mg / g enzima glucano, 48 h, 50 ° C) . "Quattro-componente commerciale" ha le proporzioni stabilite dal l'esperimento mostrato in fig. 3A.

Discussion

E 'ampiamente riconosciuto che la riduzione del costo di enzimi è importante per lo sviluppo di un settore economico di etanolo lignocellulosiche. Attualmente sono disponibili cocktail di enzimi commerciali sono miscele complesse e scarsamente definita di molte proteine ​​(Nagendran et al., 2009), e si adattano soprattutto per l'uso su pre-trattati con acido paglia del mais. Al fine di accelerare lo sviluppo di cocktail di enzimi meglio, diversi laboratori hanno sviluppato piattaforme high-throughput per la scoperta e la caratterizzazione degli enzimi. Sforzi in questo campo hanno incorporato una o più delle seguenti proprietà anche in GENPLAT: erogazione robotica di enzimi e fanghi di biomassa, il modello statistico di sperimentazione, e / o determinazione automatica di Glc e Xyl (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT estende questi sforzi in precedenza, la maggior parte in modo significativo nella complessità delle miscele enzima che può essere analizzata da un massimo di 6 componenti ini primi studi a oltre 16 nel nostro ultimo lavoro (Banerjee et al. 2010C). Altre caratteristiche chiave del GENPLAT sono l'uso di una camera di miscelazione tallone (serbatoio paddle), che può mantenere fanghi paglia sospesi durante l'erogazione, la miscela dolce durante la digestione entro la fine del-over-end di rotazione; e automatizzato determinazione colorimetrica di Glu e Xyl.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)