GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) er et automatisert plattform for oppdagelse og optimalisering av enzym cocktails for biomasse degradering. Det kan tilpasses til flere feedstocks og blandinger av enzymer som inneholder flere komponenter.
Den høye kostnaden av enzymer for biomasse dekonstruksjon er en stor hindring for den økonomiske konvertering av lignocelluloseholdige feedstocks til flytende transport drivstoff som etanol. Vi har utviklet en integrert høy gjennomstrømning plattform, kalt GENPLAT, for oppdagelsen og utviklingen av nye enzymer og enzym cocktails for frigjøring av sukker fra ulike forbehandling / biomasse kombinasjoner. GENPLAT består av fire elementer: individuelle rene enzymer, statistiske design av eksperimenter, robot pipeting av biomasse slam og enzymer, og automatisert colorimeteric fastsettelse av frigitte GLC og Xyl. Individuelle enzymer er produsert av uttrykk i Pichia pastoris eller Trichoderma reesei, eller ved kromatografisk rensing fra kommersielle cocktails eller utdrag av romanen mikroorganismer. Simplex gitteret (delvis faktoriell) blanding modeller er designet ved hjelp av kommersielle Design av Experiment statistisk programvare. Enzyme blandinger av høy komplekseligheten er konstruert ved hjelp av robot pipeting inn i en 96-brønnen format. Målingen av frigitte GLC og Xyl er automatisert bruker enzyme-linked kolorimetriske analyser. Optimalisert enzym blandinger som inneholder så mange som 16 komponenter har blitt testet på et utvalg av råstoff og forbehandling kombinasjoner.
GENPLAT kan tilpasses til blandinger av rene enzymer, blandinger av kommersielle produkter (f.eks Accellerase 1000 og Novozyme 188), ekstrakter av romanen mikrober, eller kombinasjoner av disse. Å lage og teste blandinger av ~ 10 rene enzymer krever mindre enn 100 mikrogram av hvert protein og færre enn 100 total reaksjoner, brukes ved en endelig samlet lasting av 15 mg protein / g glukan. Vi bruker enzymer fra flere kilder. Enzymer kan bli renset fra naturlige kilder, for eksempel sopp-kulturene (for eksempel Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum og Galerina marginata), eller de kan gjøres ved uttrykk for koding gener (hentet fra den økende number av mikrobiell genom sekvenser) i hosts som E. coli, Pichia pastoris, eller en filamentous sopp som T. reesei. Proteiner kan også bli renset fra kommersielle enzym cocktails (f.eks Multifect xylanase, 188 Novozyme). Et økende antall rene enzymer, inkludert glykosyl hydrolases, cellevegg-aktiv esteraser, proteaser, og lyases, er tilgjengelig fra kommersielle kilder, f.eks Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) , og PROZOMIX (www.prozomix.com).
Design-Expert programvare (Stat-Ease, Inc.) brukes til å lage simplex-gitter design og å analysere svarene (i dette tilfellet, GLC og Xyl utgivelse). Blandinger inneholder 4-20 komponenter, som kan variere i proporsjon mellom 0 og 100%. Assay poeng typisk omfatte ekstreme hjørnene med et tilstrekkelig antall gripe poeng for å generere en gyldig modell. I terminologien av eksperimentell design, de fleste av våre studier er "blanding" eksperimenter, noe som betyr at summen av enll komponenter legger til en samlet fast protein lasting (uttrykt som mg / g glukan). Antallet blandinger i simplex-gitteret avhenger både antall komponenter i blandingen og graden av polynomet (kvadratisk eller kubisk). For eksempel vil en 6-komponent eksperimentere innebære 63 separate reaksjoner med en utvidet spesielle kubisk modell, som kan oppdage treveis interaksjoner, mens bare 23 individuelle reaksjoner er nødvendig med en utvidet kvadratiske modell. For blandinger som inneholder mer enn åtte komponenter, er en kvadratisk eksperimentell design mer praktisk, og vår erfaring er slike modeller er vanligvis statistisk gyldige.
Alle enzym belastninger er uttrykt som en prosentandel av den endelige samlede lasting (som for våre eksperimenter er vanligvis 15 mg protein / g glukan). For "core" enzymer, er lavere prosentandel grensen satt til 5%. Denne grensen ble utledet fra vår erfaring i som gir av GLC og / eller Xyl var svært lav hvis noen kjerne enzym var til stede på 0%. Dårlig modeller resultat av altfor mange prøver viser svært lav GLC eller Xyl avkastning. Sette en nedre grense i sin tur bestemmer en øvre grense. Det er, for en seks-komponent eksperiment, hvis den nedre grensen for hver enkelt komponent er satt til 5%, deretter den øvre grensen for hver enkelt komponent skal være 75%. Den nedre grensen for alle andre enzymer betraktes som "tilbehør" er satt til 0%. "Core" og "tilbehøret" er noe vilkårlige betegnelser og vil variere avhengig av underlaget, men i våre studier kjernen enzymer for utgivelsen av GLC fra mais Stover består av følgende enzymer fra T. reesei: CBH1 (også kjent som Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1 (Cel7B), BG (β-glukosidase), EX3 (endo-β1 ,4-xylanase, GH10) og BX (β-xylosidase).
Det er allment anerkjent at å redusere kostnadene av enzymer er viktige for utviklingen av en økonomisk lignocelluloseholdige etanol industrien. Foreløpig tilgjengelig kommersielt enzym cocktails er komplekse og dårlig definerte blandinger av mange proteiner (Nagendran et al., 2009), og de er tilpasset hovedsakelig for bruk på syre-forbehandlet mais Stover. For å akselerere utviklingen av bedre enzym cocktails, har flere laboratorier utviklet high-throughput plattformer for enzym oppdagelse og karakterisering. Innsatsen på dette området har inkorporert en eller flere av følgende egenskaper også funnet i GENPLAT: robot dispensering av enzymer og biomasse slam, statistiske design av eksperiment, og / eller automatisk bestemmelse av GLC og Xyl (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. kong et al, 2009).. GENPLAT utvider disse tidligere innsats, mest betydelig i kompleksitet av enzymet blandinger som kan analyseres fra høyst 6 komponenter itidligere studier til mer enn 16 i vår siste arbeid (Banerjee et al. 2010C). Flere viktige funksjoner i GENPLAT er bruk av en perle blandekammer (paddle reservoar) som kan holde Stover slam suspendert under dispensering; skånsom blanding under fordøyelsen ved utgangen-over-end rotasjon, og automatisert kolorimetrisk bestemmelse av Glu og Xyl.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert delvis av US Department of Energy Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494) og tilskudd DE-FG02-91ER200021 fra US Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Chemical Sciences, geofag og biovitenskap. Vi takker John Scott-Craig og Melissa Borrusch for deres materielle og begrepsmessige bidrag.
Equipments and software used:
Reagents used: