Murint Ytlig Lymph Node Kirurgi
Summary
Att följa framskridandet av en immunrespons med tiden inom samma mus kan lymfkörtlar sekventiellt avlägsnas genom kirurgi. Här beskriver vi hur denna teknik kan utföras.
Abstract
Inom området för immunologi, att förstå progressionen av en immunrespons mot ett vaccin, en infektion eller en tumör, är svaret följs ofta över tiden. Likaså kräver studiet av lymfocyter homeostas försök tidsförlopp. Dessa studier inom samma mus är idealisk för att reducera den experimentella variationen liksom antalet använda möss. Blod tillbakadragande kan utföra experiment tidsförloppet för detta, men det ger endast information om cirkulerande lymfocyter och ger ett begränsat antal celler 1-4. Eftersom lymfocyter cirkulerar genom kroppen och är bosatt i lymfkörtlarna har olika egenskaper är det viktigt att undersöka båda platserna. Det sekventiella avlägsnandet av lymfkörtlar genom kirurgi ger en unik möjlighet att följa ett immunsvar eller immunceller expansion i samma mus över tiden. Vidare ger denna teknik mellan 1-2×10 6 celler per lymfkörtel som är tillräcklig för att perform Fenotypisk karakterisering och / eller funktionella analyser. Sekventiell lymfkörtel operation eller lymfkörtlar har framgångsrikt använts av oss och andra 5-11. Här beskriver vi hur brachialis och inguinala lymfknutor kan avlägsnas genom att ge ett litet snitt i huden på en anestesi mus. Eftersom operationen är ytlig och gjort snabbt återhämtar musen mycket snabbt läker bra och inte uppleva kraftigt smärta. Varannan dag, är det möjligt att skörda en eller två lymfkörtlar möjliggör experiment tidsförlopp. Denna teknik är därför lämplig att studera egenskaperna hos lymfkörtel-bor lymfocyter över tiden. Detta tillvägagångssätt är lämpligt för olika experimentella design och vi tror att många laboratorier skulle ha nytta av att utföra sekventiella operationer lymfkörtlar.
Protocol
Discussion
Vi har beskrivit ett protokoll för LN operation vilka kan gälla för många experimentella system. Även mycket användbara för att följa immunsvar eller immunceller homeostas, har denna teknik ett antal begränsningar. Först kan endast fyra LNS skördas. För det andra måste immunsvaret studeras vara systemisk eller förekommer i ytliga inguinal eller brakial (hud-dränerande) LNS. Slutligen är antalet skördade celler påverkas av kvaliteten på LN bort en teknisk begränsning som kan bidra till experimentell v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Sylvie Lesage och alla medlemmar Lab för kritisk läsning av protokollet. Detta arbete stöds av ett bidrag (MOP-77.545) från den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque stöds av en FRSQ Senior stipendium och Melissa Mathieu mottagna en NSERC Alexander Graham Bell Kanada Graduate stipendium.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalog number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Schering-Plough | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Boniche Animal Healthcare | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | ABBOTT | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis Ophtalmics | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
