Udarbejdelse af intakt Bovin Tail intervertebrale skiver for orgel Kultur
Summary
Denne protokol illustrerer en høst teknik til halebenshvirvel kvæg intervertebrale skiver for orgel kultur for<em> In vitro</em> Orgel kultur.
Abstract
Det intervertebral disk (IVD) er fælles i rygsøjlen forbinder ryghvirvel til ryghvirvel. Den fungerer til at overføre belastning af rygsøjlen og give fleksibilitet til rygsøjlen. Det komponerer af tre rum: den inderste kerne pulposus (NP) og omfatter af annulus fibrosus (AF), og to bruskspidserne endeplader forbinder NP og AF til vertebrale kroppen på begge sider. Discogenic smerter, muligvis forårsaget af degenerative intervertebrale disc disease (DDD) og disk herniations er blevet identificeret som et stort problem i vores moderne samfund. For at undersøge mulige mekanismer IVD-degeneration, er in vitro-orgel kultur systemer med live-disk celler yderst tiltalende. In vitro kultur intakt kvæg halebenshvirvel IVDs er avanceret til en relevant model system, der tillader studiet af mekanisk-biologiske aspekter i en velkontrolleret fysiologiske og mekaniske miljø. Bovin hale IVDs kan fås relativt let i højere tal end er meget lig den menneskelige lumbal IVDs med hensyn til celletæthed, cellepopulation og dimensioner. Men tidligere kvæg caudale IVD Høstningen fastholde bruskspidserne endeplader og benet endeplader mislykkedes efter 1-2 dage i kultur siden ernæring veje tydeligvis var blokeret af størknet blod. IVDs er de største avascular organer dermed de næringsstoffer til cellerne i NP er udelukkende afhængig diffusion via kapillar knopper fra det tilstødende vertebrale kroppen. Tilstedeværelse af knogle-rester og størknet blod på gavl overflader kan hindre næringsstoffer diffusion ind i midten af disken og kompromis cellernes levedygtighed. Vores gruppe etableret en relativt hurtig protokol til "crack"-ud IVDs fra halen med en lav risiko for forurening. Vi er i stand til at permeabilize af nyslået knoklet gavl overflader ved hjælp af en kirurgisk jet lavage system, der fjerner blodpropper og opskæring snavs og meget effektivt genåbner ernæring diffusion vejtil midten af IVD. Tilstedeværelsen af vækst plader på begge sider af vertebrale knogle skal undgås, og skal fjernes forud for kultur. I denne video, skitsere vi det afgørende trin under tilberedningen og demonstrere nøglen til en vellykket orgel kultur opretholde en høj cellelevedygtighed i 14 dage under fri hævelse kultur. Kulturen tid kunne udvides når det er hensigtsmæssigt mekaniske miljø kan opretholdes ved hjælp af mekaniske laste bioreaktor. Teknikken viste her, kan udvides til andre dyrearter såsom svin, får og leporine caudale og lumbalt IVD isolation.
Protocol
Discussion
Det første skridt for en vellykket orgel kulturen er at sikre, at eksplantation ikke burde være forurenet. Halen bør være flået, inden du starter med proceduren. Enhver dyrehår kørt ind i et sterilt laboratorium kan være problematisk i forhold til forurening. Kvæg Halen bør ideelt set være så friske som muligt (dette påvirker første celle levedygtighed). Desuden er betadine vasketrin anbefales at reducere risikoen for forurening yderligere. I stedet for at bruge en custom-made kniv indehaveren og en hammer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev støttet af den schweiziske National Science Foundation (SNF # 310030-127586/1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
References
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture. Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).
- Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion. Spine (Phila Pa 1976). , (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers. Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system. Spine. 31, 2918-2925 (2006).
- Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs. Spine. 31, 2665-2673 (2006).
- Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent. J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).
- Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology. Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).
- Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. European Spine Journal. , 1-11 (2011).
