Voorbereiding van de Intact Bovine Tail tussenwervelschijven voor orgel Cultuur
Summary
Dit protocol geeft een oogst techniek voor coccygeale runderen tussenwervelschijven voor orgel cultuur<em> In vitro</em> Orgelcultuur.
Abstract
De tussenwervelschijf (IVD) is het gewricht van de wervelkolom verbinden wervel naar wervel. Het functioneert het laden van de wervelkolom doorgeven en de flexibiliteit te geven aan de wervelkolom. Het bestaat uit een drie compartimenten: de binnenste nucleus pulposus (NP), omvat door de annulus fibrosus (AF), en twee kraakbeen eindplaten het aansluiten van de NP en AF aan het wervellichaam aan beide zijden. Discogene pijn mogelijk veroorzaakt door degeneratieve tussenwervelschijf ziekte (DDD) en herniaverwijdering is geïdentificeerd als een groot probleem in onze moderne samenleving. Voor het bestuderen van mogelijke mechanismen van de IVD-degeneratie, zijn in vitro orgelcultuur systemen met een live-cd cellen zeer aantrekkelijk. De in vitro cultuur van intacte runderen coccygeale IVD's is gevorderd tot een relevant model systeem, dat de studie van mechano-biologische aspecten in een goed gecontroleerde fysiologische en mechanische omgeving mogelijk maakt. Bovine staart IVD's kan worden verkregen relatief eenvoudig in hogere aantallen eend zijn zeer vergelijkbaar met de menselijke lumbale IVD's met betrekking tot cel-dichtheid, celpopulatie en afmetingen. Echter, vorige runderen staart IVD oogsttechnieken behoud van kraakbeen en bot eindplaten eindplaten niet na 1-2 dagen van cultuur sinds de voedings-routes zijn duidelijk geblokkeerd door geronnen bloed. IVD's zijn de grootste avasculaire organen, dus de voedingsstoffen naar de cellen in het NP uitsluitend afhankelijk zijn van diffusie via de capillaire knoppen van de aangrenzende wervellichaam. De aanwezigheid van bot puin en geronnen bloed op de eindplaat oppervlakten kunnen hinderen voedingsstoffen diffusie in het midden van de schijf en compromis levensvatbaarheid van de cellen. Onze groep is een relatief snelle protocol "crack"-out van de IVD van de staart met een laag risico op besmetting. We zijn in staat om de vers gesneden benige eindplaat oppervlakken permeabilize door middel van een chirurgische jet lavage systeem, dat het bloed stolt en snijden vuil verwijdert en zeer efficiënt heropent de voeding diffusie padnaar het centrum van de IVD. De aanwezigheid van de groei platen aan beide zijden van de wervelkolom bot moet worden vermeden en worden verwijderd voordat de cultuur. In deze video, schetsen we de cruciale stappen tijdens de bereiding en demonstreren van de sleutel tot een succesvolle orgelcultuur het handhaven van hoge levensvatbaarheid van de cellen gedurende 14 dagen onder vrije zwelling cultuur. De cultuur tijd zou kunnen worden uitgebreid indien nodig de mechanische omgeving kan worden gehandhaafd met behulp van mechanische belasting bioreactor. De techniek blijkt hier kan worden uitgebreid tot andere diersoorten, zoals varkens, schapen, hazen-caudale en lumbale IVD isolatie.
Protocol
Discussion
De eerste stap voor een succesvolle orgelcultuur is om ervoor te zorgen dat de explantatie niet moet worden besmet. De staart moet worden gevild voordat u start met de procedure. Alle dierlijk haar gebracht in een steriele laboratorium kan problematisch zijn in termen van besmetting. De runderen staart moet bij voorkeur zo vers mogelijk (dit van invloed op de initiële levensvatbaarheid van de cellen). Bovendien wordt de Betadine wasstap aanbevolen om het risico van besmetting nog verder afneemt. In plaats van het gebru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNF # 310030-127586/1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
References
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture. Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).
- Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion. Spine (Phila Pa 1976). , (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers. Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system. Spine. 31, 2918-2925 (2006).
- Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs. Spine. 31, 2665-2673 (2006).
- Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent. J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).
- Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology. Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).
- Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. European Spine Journal. , 1-11 (2011).
