Preparação de Intact Discos cauda bovina Intervertebral de Cultura de Órgãos
Summary
Este protocolo ilustra uma técnica de colheita, para coccígea bovina discos intervertebrais para a cultura de órgãos para<em> In vitro</em> Cultura do órgão.
Abstract
O disco intervertebral (IVD) é a articulação da coluna vertebral conectando vértebra em vértebra. Ele funciona para transmitir carga de coluna vertebral e dar flexibilidade à coluna vertebral. Compõe de três compartimentos: o núcleo pulposo interior (NP) que abrange pelo anel fibroso (AF) e duas placas terminais cartilaginosas que liga o NP e AF do corpo vertebral em ambos os lados. Dor discogênica possivelmente causada por uma doença degenerativa do disco intervertebral (DDD) e hérnia discal tem sido identificada como um problema grave em nossa sociedade moderna. Para estudar possíveis mecanismos de degeneração IVD, em sistemas de órgãos de cultura in vitro com células de discos ao vivo são altamente atraente. O cultivo in vitro de bovinos intactos IVDs coccígea tem avançado a um sistema-modelo relevante, que permite o estudo de mecano-biológico aspectos em um ambiente bem controlado fisiológicas e mecânicas. IVDs cauda de bovinos podem ser obtidos relativamente fácil em maior número umd são muito semelhantes ao humano IVDs lombar em relação à densidade celular, a população de células e dimensões. No entanto, anterior caudal bovina técnicas de colheita IVD retenção placas terminais cartilaginosas e ósseas placas terminais falhou após 1-2 dias de cultura desde as vias de nutrição foram, obviamente, bloqueada por sangue coagulado. IVDs são os maiores órgãos avascular, assim, os nutrientes para as células do NP são exclusivamente dependentes de difusão através da brotos capilares do corpo vertebral adjacente. Presença de resíduos de osso e sangue coagulado nas superfícies placa motora pode dificultar a difusão de nutrientes para o centro do disco e viabilidade celular compromisso. O nosso grupo estabeleceu um protocolo relativamente rápida de "crack"-out do IVDs da cauda com um baixo risco de contaminação. Somos capazes de permeabilizar o recém-cortadas superfícies ósseas placa terminal usando um sistema de lavagem a jato cirúrgica, que remove os coágulos de sangue e restos de corte e de forma muito eficiente reabre o caminho de difusão de nutriçãopara o centro do IVD. A presença de placas de crescimento em ambos os lados do osso vertebral tem que ser evitado e ser removidos antes da cultura. Neste vídeo, que descrevem as etapas cruciais durante a preparação e demonstrar a chave para uma cultura de órgão bem-sucedido manter a viabilidade celular de alta por 14 dias, sob inchaço cultura livre. O tempo de cultura poderia ser estendido quando o ambiente mecânico adequado pode ser mantida usando biorreator carga mecânica. A técnica demonstrada aqui pode ser estendido a outras espécies animais, como suínos, ovinos e isolamento caudal e lombar leporinos IVD.
Protocol
Discussion
O primeiro passo para a cultura de órgão bem-sucedido é ter certeza de que o explante não deve ser contaminada. A cauda deve ser descascado antes de começar com o procedimento. Qualquer pêlos levados a um laboratório estéril pode ser problemático em termos de contaminação. A cauda bovina deveriam idealmente ser o mais fresco possível (isso afeta a viabilidade celular inicial). Além disso, a etapa de lavagem betadine é recomendada para reduzir o risco de novas contaminações. Em vez de usar uma lâmina cus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi apoiado pela National Science Foundation suíço (SNF # 310030-127586/1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
References
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