器官培養のための無傷牛テール椎間板の準備
Summary
このプロトコルは、のための器官培養のための尾骨ウシ椎間板のための収穫技術を示しています。<em> in vitroで</em>器官培養。
Abstract
椎間板（IVD）は椎骨に椎を接続する脊椎の関節です。それは、背骨の荷重を伝達し、背骨に柔軟性を与えるために機能します。線維輪（AF）で取り囲む最も内側の髄核（NP）、および両側の椎体にNPとAFを接続する2つの軟骨終板：それは3つの区画から構成している。おそらく変性椎間板疾患（DDD）と椎間板ヘルニアが原因で椎間板の痛みは私達の現代社会における主要な問題として同定されている。 IVD変性の機序を調べるために、ライブディスクの細胞を用いたin vitro器官培養系で非常に魅力的です。そのままウシ尾骨IVDsのin vitro培養十分に制御生理学的および機械的な環境におけるメカノ生物学的側面 の研究を可能にする、関連するモデルシステム、に進んでいる。牛テールIVDsは高い数値で、比較的容易に得ることができますdは、細胞密度、細胞集団と寸法に関する人間の腰椎IVDsと非常によく似ています。栄養経路が明らかに凝固した血液によってブロックされたしかし、軟骨終板と骨のエンドプレートを保持し、前のウシ尾IVD収穫テクニックは、文化の1〜2日後に失敗しました。 IVDsが最大の無血管器官である、したがって、NPの細胞への栄養素は、隣接する椎体から毛細管芽を経由して拡散にもっぱら依存しています。エンドプレートの表面上に骨の破片と血餅の存在は、ディスクと妥協の細胞の生存の中心に栄養の拡散を妨げることができる。当社グループは、汚染のリスクが低いとアウトテールからIVDsを"クラック"することは比較的迅速なプロトコルを確立した。我々は、血栓や切削屑を除去し、非常に効率的に栄養の拡散経路を再オープン外科ジェット洗浄システムを使用して、切りたての骨端板の表面を透過することができますIVDの中心に。脊椎骨の両側の成長板の存在は、避けるべきと前の文化に削除する必要があります。このビデオでは、我々は準備中に重要なステップを概説し、無料の腫れ文化で14日間高い細胞生存率を維持し成功した器官培養するキーを示しています。培養時間は、適切な機械的な環境が機械的荷重のバイオリアクターを使用して維持することができるときに拡張することができる。ここで示した手法は、ブタ、ヒツジ及びウサギの尾と腰IVD分離など他の動物種に拡張することができます。
Protocol
Discussion
成功した器官培養のための最初のステップは、外植片が汚染されるべきではないことを確認することです。この手順を始める前に尾にはスキンは適用されるべきである。無菌室に持ち込むあらゆる動物の毛は、汚染の点で問題である可能性があります。牛テールは、理想的に（これは初期の細胞の生存に影響を与える）可能な限り新鮮なはずです。さらに、betadineの洗浄工程は、さらなる汚?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、スイス国立科学財団（SNF＃310030-127586/1）によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
References
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