封装在一个交联的聚乙二醇水凝胶的细胞照片的方法描述。使用荧光标记系统内缺氧的信号封装小鼠胰岛素(MIN6)聚合跟踪。这个系统允许在水凝胶支架和相关的缺氧信号串行检查细胞与细胞表型的变化。
在1型糖尿病,胰腺β细胞中胰岛素的生产损失和潜在的致命性高血糖的结果的自身免疫性破坏。作为一种替代治疗选择外源性胰岛素注射,功能胰腺组织移植已探索 1,2 。这种方法提供了更自然,恢复正常血糖长期承诺。从宿主的免疫系统是必需的捐助组织的保护,以防止排斥和封装是用来帮助实现这一目标的方法。
生物衍生材料,如海藻酸钠3和琼脂糖4,已经胶囊建设传统的选择,但可能会引起炎症或纤维化繁茂5可以阻碍养分和氧气的运输。另外,合成聚乙二醇(PEG)凝胶的非降解,易功能化,高纯度,可控孔径,是非常具有生物相容性,6,7,8。作为一个额外的好处,PEG水凝胶可迅速形成一个简单的光交联反应,不需要申请非生理温度6,7。这里描述的是这样一个过程。在交联反应,光引发剂的UV退化,1 – [4 – (2 – 羟乙氧基)苯基] -2 – 羟基-2 – 甲基丙烷- 1 -(Irgacure 2959),产生自由基攻击乙烯的碳 – 碳双dimethacrylated PEG(PEGDM)诱导交联的债券链的末端。在10分钟内就可以实现交联。以这种方式建造的聚乙二醇水凝胶已被证明有利的支持细胞 7,9,和光引发剂浓度低,并简短地暴露在紫外线的照射是不会损害10封装的组织的活力和功能。虽然我们甲基丙烯酸聚乙二醇与方法如下所述,PEGDM也可以DIRectly从Sigma公司,如供应商购买。
一个封装的固有后果是细胞从血管网的隔离。营养物质的供应,特别是氧气,因此,减少和限制扩散。这减少的氧气供应,尤其是可能影响β细胞的胰岛素分泌功能是高度依赖氧气 11-13 。胶囊成分和几何也将影响对氧的扩散速度和长度。因此,我们还描述了确定乏氧细胞内的聚乙二醇胶囊的技术。与重组的腺病毒的细胞感染允许一个荧光信号产生时,细胞内缺氧诱导因子(HIF) 途径激活14。由于HIFs转录缺氧反应的主要监管机构,他们所代表的理想目标标记检测缺氧信号15。这种方法允许hypoxi简便,快速检测C细胞。简单地说,腺病毒有一个缺氧反应元件(HRE)三聚体的控制下,红色荧光蛋白的序列(DS红DR自Clontech)。低氧气条件下稳定HIF – 1,将驱动器的荧光蛋白(图1)的转录。对这种病毒的建设更多细节已公布以前 15 。该病毒是存储在10%甘油于-80 ° C的很多150微升1.5 mL离心管分装在一个3.4 × 10 10 PFU / mL的浓度。
在我们的实验室以往的研究表明,MIN6细胞封装为聚合整个文化周在20%的氧气维持其可行性。 MIN6聚集培养2或1%的氧气表明:用溴化乙锭染色,以及相对20%的氧气,细胞形态的变化,坏死细胞的两个标志(仍然可行的约85-90%)。顺利球形显示20%的聚集是洛杉矶T和聚合似乎更喜欢杂乱无章的细胞群体。虽然含氧量低应力不会导致在生存能力明显下降,这显然是影响MIN6聚集和功能为测量血糖刺激胰岛素分泌15。封装的细胞在20%和1%的氧气西方印迹分析还显示,为DsRed的议员蛋白表达与低氧条件下培养的细胞中HIF -1α的显著增加。
这里介绍的方法,提供了一个细胞封装在非生理条件下的最小使用PEG凝胶快速和简单的技术。 PEG代表一个非常有用的封装材料,其生物相容性和易于修改。简单的PEG在光敏溶液的百分比变化,例如,可用于调节通过孔径的机械性能,如压缩模量和输运性质。此外,PEG很容易修改,除了侧链。聚乙二醇水凝胶,因此,是一种很有前途的临床设备和灵活的平台, 在体外研究
跟踪PEG封装细胞缺氧的方法也被提出。缺氧检测的简单性和避免需要的利益而牺牲的细胞,这种方法非常有用。该技术可应用于多种类型的细胞在其我们的各种条件efulness广泛。例如,作为干细胞分化的提示缺氧可能是干细胞微团培养跟踪。但是,这种方法只能适用于分散的电池系统或系统中,分散细胞后汇总。此外,检测荧光信号可能难以在更大或更密集的组织。
The authors have nothing to disclose.
感谢慷慨提供MIN6细胞克丽斯蒂Anseth的科罗拉多大学的实验室。这个项目的资金已经由美国国家科学基金会提供。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional |
PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
Microwave | Emerson | MW8784SB | |
Vortexer | Scientific Industries | SI-A236 | |
Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
Laboratories | |||
Freezer | |||
Lyophilizer | Labconco | 7670521 | |
Vacuum pump | Welch | 8917Z-01 | |
Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
HBSS | Mediatech | 21-022-CV | |
Syringe Filter | VWR | 28145-477 | |
RPMI 1640 | Mediatech | * | *custom formulation |
FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
Amphotericin B | Mediatech | 30-003-CF | |
Incubator | Thermo Scientific | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
Trypsin EDTA | Mediatech | 25-052-CI | |
Orbital Shaker | VWR | 12620-926 | |
UV Lamp | Sanyo Denri | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
Microscope | Nikon | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |