Seguimiento de señalización dentro de los agregados de células hipóxicas encapsulado

Summary

Un método para la foto-encapsulación de células en un hidrogel de PEG reticulado se describe. Señalización de hipoxia en insulinoma murino encapsulado (MIN6) agregados se realiza un seguimiento mediante un sistema de marcadores fluorescentes. Este sistema permite el examen de serie de células dentro de un hidrogel de andamios y la correlación de las señales de hipoxia con los cambios en el fenotipo celular.

Abstract

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic β-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored^1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host’s immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.

Biologically-derived materials, such as alginate³ and agarose⁴, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth⁵ which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,^6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures^6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells^7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue¹⁰. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.

An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact β-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen^11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated¹⁴. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling¹⁵. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously¹⁵. The virus is stored in 10% glycerol at -80° C as many 150 μL aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 10¹⁰ pfu/mL.

Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion¹⁵. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1α for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

Protocol

1. PEGDM síntesis y PEGDM fotoactivos preparación de la solución de macrómero Pesar 2 g de PEG (lineal, 10.000 Da) en un vial de vidrio de 40 ml con una tapa de plástico duro. Añadir aproximadamente 308μL de anhídrido metacrílico y libremente tapa del frasco. Microondas en el vial de alto por 2 minutos en un horno de microondas doméstico estándar. El uso de guantes resistentes al calor, a fondo vórtice del vial, a continuación, microondas a máxima potencia durante 5 minutos. En pocas palabras permiten al vial que se enfríe lo suficiente como para ser manejados con guantes. Destape y agregue lentamente que el cloruro de metileno, mientras que hace girar el vial. Agregar suficiente para que la solución parece clara y homogénea, agitación de la muestra, según sea necesario. El volumen total de cloruro de metileno utilizado debe ser de 1,5 – 2 ml. PEGDM precipitado en 200 ml de frío, se agita éter dietílico mediante la adición de la solución gota a gota. Recoge los PEGDM por filtración al vacío y deje que se seque. Disolver el PEGDM en una cantidad adecuadade agua desionizada (típicamente 100 a 150 ml). La solución de diálisis contra agua desionizada durante 5 días en tubos de diálisis con un peso molecular de corte de 1000 Da. Reemplazar el agua una vez al día. Alícuota de la solución en recipientes adecuados y se congelan a -80 ° C durante la noche. Liofilizar la solución durante 4 días para producir un polvo blanco PEGDM purificada. Guarde el polvo a 4 ° C cuando no se utiliza. Para preparar una solución PEGDM fotoactivos, en primer lugar elaborar un 0,5 por ciento en peso fotoiniciador solución madre disolviendo Irgacure 2959 en agua desionizada. Vortex la solución y guardarla en la oscuridad. Prepare una PEGDM 10% en peso y 0,025% en peso de 2959 Irgacure solución en solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Vortex a fondo para asegurar la disolución de la PEGDM. Nos suelen preparar 1 ml de esta solución a la vez. Esterilizar la solución por filtrado a través de un filtro de 0,2 micras de la jeringa en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml. Envuelva el tubo con papel de aluminioy se almacena a 4 ° C 2. La cultura, la infección, y la agregación de células MIN6 MIN6 células se cultivan en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%, la glucosa de 7 mm, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina y 0,5 mg / mL anfotericina B en un ambiente humidificado a 37 º C y 5% CO 2. Para liberar las células de la superficie de cultivo tratada frasco, aspire el medio, lavar las células con 37 ° C de calcio / magnesio libre de HBSS, aspirar el HBSS, a continuación, agregar 2 ml de 37 ° C con tripsina-EDTA y permitir que las células incubar durante 3 minutos. Jar firmemente del lado de la botella para golpear a las células libres, y se añaden 8 ml de 37 º C y la media pipeta vigorosamente la suspensión celular arriba y hacia abajo con cuidado de no introducir burbujas. Pipeta las células en un tubo de centrífuga estéril 15 ml y llevar a cabo un recuento de células utilizando un hemocitómetro o celulares contar procedimiento. En la preparación para infectar las células con el fabricantevirus, primero se determina el número total de células que están infectadas y calcular el volumen de suspensión de virus necesaria para lograr la multiplicidad deseado de infección (MOI) (50 a 100 partículas infecciosas por célula). Diluir el virus en HBSS cuidadosamente pipeta la cantidad apropiada de suspensión de virus en un volumen pre-alícuotas de HBSS en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml. 50 l de HBSS por pocillo de células de agregación es la adecuada. Dispersar las células por la pipeta hacia arriba y hacia abajo en su tubo, pipeta el volumen necesario para alcanzar 400.000 células por pocillo en los pocillos de una placa de suspensión de 6 pocillos. Añadir la cantidad apropiada de virus diluido a cada pocillo para lograr el deseado momento de inercia. Añadir a cada pocillo medio para llevar el volumen total de hasta 1,7 ml. Colocar la placa en un agitador orbital dentro de la incubadora. Establecer la coctelera en un nivel bajo para que el medio lava suavemente alrededor de los pozos (~ 100 rpm). Permitir que las células de la agregaciónte de 24 a 36 horas. Agregados con un diámetro aproximado de 75 a 175 micras deben ser formados. 3. La encapsulación de células en PEGDM Las células pueden ser encapsulados en forma de dispersión (paso 2.4) o la agregación siguiente (paso 2,10). Desde el precursor de hidrogel PEGDM solución es un líquido, las células tienden a establecerse antes de la reticulación y la formación del hidrogel. Si la liquidación se espera que ocurra rápidamente, por ejemplo, con agregados de mayor tamaño, puede ser beneficioso para producir el hidrogel en dos pasos para que las células se depositan en un plano central del gel. Un procedimiento de hidrogel de una etapa de síntesis adecuada de las células dispersas se muestra (Figura 2) y el procedimiento de dos pasos se muestra así (Figura 3) y se detallan a continuación (3.2-3.9). Crear un recipiente en el que será el hidrogel formado por el corte de la punta cónica de una jeringa de plástico de 1 ml y colocarlo abertura hacia arriba en un estante. Pipetear 20 L de PEGDM fotoactivos paralución en el extremo abierto de la jeringa sobre el émbolo de asegurarse de que el volumen cubre toda la superficie del émbolo. Ajustar el émbolo en pequeños incrementos hasta conseguir una superficie plana de líquido. Coloque la pipeta en el soporte y la posición de la parrilla por debajo de una lámpara UV (365nm, ~ 7 mW / cm 2) durante aproximadamente 8 minutos para permitir que para el entrecruzamiento del hidrogel. Durante este tiempo, la preparación de las células puede ser iniciado Pipeta un volumen que contiene el número deseado de células / agregados en un tubo de microcentrífuga de 1,8 mL, la tapa y centrifugar el tubo a 130 g durante 5 minutos. Utilizando una micropipeta, retirar con cuidado los medios de comunicación sin perturbar el sedimento celular en la punta del tubo. A medida que la cabeza se aproxima a la media pastilla, puede ser útil usar una más fina, punta de la pipeta 10 mL. Suavemente resuspender el botón celular en 20 l de solución de fotoactivos PEGDM (use una punta de pipeta de boca ancha, si se trabaja con agregados) y añadir la suspensión celular a la jeringa en la parte superior de the previamente reticulado parte de hidrogel. Exponer la jeringa a un adicional de 8 minutos de luz UV para completar la construcción del hidrogel. Cuando haya terminado, las células deben estar completamente encapsulado dentro del hidrogel cilíndrico (Figura 3). Expulsar el hidrogel de la jeringa y en 1 ml de HBSS en el pozo de una placa de 24 pozos para lavar brevemente el gel. Transferir el gel a 1 ml de los medios de comunicación en el pozo de una placa de 24 pozos y la cultura en las condiciones deseadas. 4. El seguimiento de la hipoxia En cualquier momento de la cultura, la imagen de las células mediante microscopía de fluorescencia para rastrear el inicio de la señalización de la hipoxia. Dependiendo de lo que se va a examinar se puede la imagen de la placa multi-bien o transferir el gel a un portaobjetos de microscopio antes de colocarlo en la platina del microscopio. Pico de excitación Ds Red se logra a 556nm y emisión máxima se produce a 586nm. Emisión es bastante intenso y por lo tanto no ha sido photobleaching observadoresed a ser problemático. Tiempo de retraso entre el inicio de la producción de proteínas y la detección de la primera señal es de aproximadamente 12 horas. La señal es lo suficientemente específico para identificar las células individuales de la señalización, pero la resolución puede ser insuficiente para determinar la localización intracelular de la señal. En las células de señalización, señales que normalmente se observa de manera uniforme por todo el citoplasma. Intensidad de la señal también puede aumentar con la exposición prolongada a la hipoxia, a pesar de que aún no han determinado si esto se debe al aumento de expresión de la proteína, la acumulación de proteínas en general, o proteínas de maduración retardada. 5. Los resultados representativos Un ejemplo representativo de MIN6 agregados encapsulados en un hidrogel de PEG se muestra en la Figura 4. El gel reticulado será sólida en todo, tomando la forma del recipiente en el que se llevó a cabo la reacción. Un gel con suaves superficies exteriores es preferible para la implantación de la ayuda en la prevención de un nuevo cuerpo extrañorespuesta. En el gel, los agregados de células deberían estar totalmente cerradas en la matriz y homogéneamente distribuidos para permitir un mejor transporte de nutrientes. Imágenes representativas de la señalización de hipoxia en MIN6 agregados se muestran en la Figura 5. Idéntica MIN6 agregados infectados con el virus marcador fueron cultivadas en un 20% de O 2 (5 bis) o el 1% de O 2 (5b) durante 44 horas antes de la captura de imágenes. Figura 1. Esquema de la actividad de nuestro sistema de marcador de hipoxia. Inserción adenoviral de la Ds Red DR gen promotor aguas arriba y educación en derechos humanos permite la hipoxia inducida por la producción de la proteína fluorescente bajo el control de HIF-1. Figura 2. Diagrama de flujo del procedimiento para la encapsulación de un solo paso de la dispersión de las células en un MIN6 crosslinked hidrogel PEGDM. Para cada gel, las células dispersas se suspenden en 40μL de la solución de macrómero fotoactivos PEGDM. Este se coloca en una jeringa de 1 ml y decapitado el hidrogel se forma bajo la luz UV 365 nm después de 10-12 minutos. Una vez terminado, el disco de hidrogel se retira la jeringa, se lavan y se colocan en un plato y medio llena de incubación. Figura 3. Diagrama de flujo del procedimiento para la encapsulación de doble paso de agregados de células MIN6 en un hidrogel reticulado PEGDM. Para cada gel, medio-gel se formó por primera vez por reticulación UV de 20μL de la solución de macrómero fotoactivos PEGDM durante 8 minutos. MIN6 agregados son cuidadosamente suspendidos en una solución adicional de 20μL fotoactivos macrómero que se añade en la parte superior de la pre-formados semi-gel. El gel completo está formado por un adicional de 8 minutos de exposición UV con agregados encapsulados en el medioplano de la gel. Figura 4. Imagen de un hidrogel de 40μL en 20X. MIN6 agregados (~ 400.000 células totales) se ven claramente en el gel. Diámetro es de aproximadamente 6 mm de hidrogel (barra = 1 mm). Hipoxia Figura 5. Fluorescentes de señalización en las células MIN6 agregados en un hidrogel PEGDM. Las células que se concentraron y se coloca en la incubación a 20% de O 2 durante 44 horas no muestran señales de hipoxia (a) mientras que las células que se concentraron luego incubadas en el 2% de O 2 por 44 horas de visualización de la señal clara, en todas partes. (Barra = 100μm) (b).

Discussion

El método que aquí se presenta ofrece una técnica rápida y sencilla para la encapsulación de células en un hidrogel de PEG con un uso mínimo de condiciones no fisiológicas. PEG representa un material de encapsulación de gran utilidad para su biocompatibilidad y facilidad de modificación. Simple variación del porcentaje de PEG en la solución de fotoactivos, por ejemplo, se puede utilizar para ajustar las propiedades mecánicas, como el módulo de compresión, y las propiedades de transporte a través del tamaño de los poros. Además, el PEG es fácil de modificar por la adición de cadenas laterales. Hidrogeles de PEG, por lo tanto, representan tanto un dispositivo prometedor clínica y una plataforma flexible para la investigación in vitro

Un método para el seguimiento de la hipoxia en las células encapsuladas PEG-También se ha presentado. Este método es útil para la simplicidad de la detección de la hipoxia y para evitar la necesidad de sacrificar las células de interés. La técnica se puede aplicar a una variedad de tipos de células en una variedad de condiciones lo que nos de suefulness amplio. Por ejemplo, la hipoxia como señal para la diferenciación de células madre puede ser rastreado en las culturas madre micromasa celular. Sin embargo, este método sólo puede aplicarse a sistemas dispersos de células o sistema en el que dispersa las células son luego agregados. Además, la detección de la señal fluorescente puede ser difícil en los tejidos más grandes o más densas.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
Methacrylic Anhydride	Sigma-Aldrich	276685-100ML
Microwave	Emerson	MW8784SB
Vortexer	Scientific Industries	SI-A236
Methylene Chloride	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	346136-1L
Dialysis Tubing	Spectrum	132640
	Laboratories
Freezer
Lyophilizer	Labconco	7670521
Vacuum pump	Welch	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21-022-CV
Syringe Filter	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	*custom formulation
FBS	PAA Laboratories	A15-351
Penicillin-Streptomycin	Mediatech	30-002-CI
Amphotericin B	Mediatech	30-003-CF
Incubator	Thermo Scientific	3597	Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression
Trypsin EDTA	Mediatech	25-052-CI
Orbital Shaker	VWR	12620-926
UV Lamp	Sanyo Denri	FLR40SBLB/M	Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs
Centrifuge	Eppendorf	5811 000.010*	*order number.  Model 5810 R
Microscope	Nikon	TI-ND6-PFS	With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission