איתות hypoxic מעקב בתוך תא מצרפי Encapsulated

Summary

שיטה אנקפסולציה, צילום של תאים הידרוג PEG crosslinked מתואר. איתות hypoxic בתוך insulinoma Murine במארז (MIN6) אגרגטים הוא מעקב באמצעות מערכת סמן פלואורסצנטי. מערכת זו מאפשרת בחינה סדרתי של תאים בתוך הידרוג הפיגום המתאם של איתות hypoxic עם שינויים פנוטיפ התא.

Abstract

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic β-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored^1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host’s immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.

Biologically-derived materials, such as alginate³ and agarose⁴, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth⁵ which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,^6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures^6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells^7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue¹⁰. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.

An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact β-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen^11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated¹⁴. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling¹⁵. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously¹⁵. The virus is stored in 10% glycerol at -80° C as many 150 μL aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 10¹⁰ pfu/mL.

Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion¹⁵. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1α for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

Protocol

1. PEGDM סינתזה PEGDM photoactive macromer הכנה פתרון לשקול 2g של PEG (ליניארי, 10,000 Da) לתוך בקבוקון זכוכית 40mL עם מכסה פלסטיק קשיח. הוסף כ 308μL של אנהידריד methacrylic ואת כובע רופף את הבקבוקון. מיקרוגל את הבקבוקון על גבוה למשך 2 דקות במיקרוגל ביתי רגיל. חום לבישת כפפות עמידות, מערבולת ביסודיות את הבקבוקון, אז מיקרוגל גבוה עבור 5 דקות נוספות. בקצרה לאפשר הבקבוקון להתקרר מספיק כדי להיות מטופלים עם כפפות. פותח את הפקק לאט להוסיף מתילן כלוריד בעוד מתערבל את הבקבוקון. הוסף מספיק כך שהפתרון נראה ברור ואחיד, vortexing המדגם לפי הצורך. ההיקף הכולל של מתילן כלוריד המשמש צריך להיות 1.5-2 מ"ל. PEGDM המשקע ב 200 מ"ל של קר, עוררה אתר diethyl ידי הוספת dropwise פתרון. אסוף את PEGDM על ידי סינון ואקום ולאפשר לו להתייבש. ממיסים את PEGDM בסכום הולםמים deionized (בדרך כלל 100 -150 מ"ל). Dialyze הפתרון נגד מים deionized במשך 5 ימים בצינור דיאליזה בעל משקל מולקולארי חתך של 1000 Da. החלף את המים פעם ביום. Aliquot הפתרון לתוך מכולות מתאים להקפיא ב -80 מעלות למשך הלילה. Lyophilize הפתרון במשך 4 ימים להניב מטוהרים לבן אבקת PEGDM. אחסן את האבקה על 4 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. כדי להכין פתרון PEGDM photoactive, תחילה להכין 0.5 אחוזים במשקל photoinitiator פתרון המניות על ידי המסת Irgacure 2959 במים deionized. הפתרון וורטקס ולאחסן אותו בחושך. הכן PEGDM 10 wt% ו 0.025% wt Irgacure 2959 פתרון תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS). וורטקס ביסודיות כדי להבטיח פירוק PEGDM. אנחנו בדרך כלל להכין 1mL של פתרון זה בכל פעם. לעקר את הפתרון על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק לתוך צינור microcentrifuge 1.8 מ"ל. לעטוף את הצינור בנייר אלומיניוםולאחסן ב 4 ° C 2. תרבות, זיהומים, הצטברות של תאים MIN6 MIN6 תאים בתרבית בינוני 1640 RPMI בתוספת 10% FBS, גלוקוז 7mm, 100 יחידות / מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין, ועל 0.5 מיקרוגרם / מ"ל amphotercin B בסביבה humidified ב 37 ° C ו 5% CO 2. כדי לשחרר את התאים מן השטח טופלו בקבוק תרבות, לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים עם 37 ° C סידן / מגנזיום ללא HBSS, לשאוב HBSS, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של 37 ° C-EDTA טריפסין פתרון ולאפשר לתאים דגירה במשך 3 דקות. היטב בצנצנת את הצד של הבקבוק כדי להפיל את התאים ללא תשלום, ולאחר מכן להוסיף 8 מ"ל של 37 ° C ו-בינוני במרץ פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה מקפיד שלא להכניס בועות. פיפטה את התאים לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל ולבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer או תאים אחרים ספירת ההליך. בהכנת להדביק את התאים עם יצרניתהנגיף, תחילה לקבוע את המספר הכולל של תאים להיות נגוע לחשב את עוצמת הקול של השעיה וירוס הנדרש כדי להשיג את הרצוי ריבוי של זיהום (משרד הפנים) (5-10 חלקיקים זיהומיות לכל תא). לדלל את הנגיף HBSS בקפידה על ידי pipeting את הכמות הנכונה של השעיה וירוס לתוך נפח טרום aliquoted של HBSS בתוך צינור microcentrifuge 1.8 מ"ל. 50 μL של HBSS לכל טוב של תאים צבירה המתאים. לפזר את התאים על ידי pipeting אותם למעלה ולמטה הצינור שלהם, אז pipet נפח הדרושים כדי להשיג 400,000 תאים לכל גם לתוך הבארות של צלחת 6-היטב בתרבות ההשעיה. הוספת נפח מתאים של הנגיף מדולל היטב כל אחד כדי להשיג את הרצוי משרד הפנים. הוסף בינוני עד טוב כל כדי להביא את הנפח הכולל של עד 1.7 מ"ל. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית בתוך האינקובטור. הגדר את שייקר על הגדרה נמוכה, כך המדיום בעדינות שוטף סביב בארות (~ 100 סל"ד). אפשר את התאים aggregate עבור 24-36 שעות. המצרפים בקוטר משוער של 75-175 מיקרומטר צריך להיווצר. 3. Encapsulation של תאים PEGDM תאים עשויים להיות במארז כמו פיזור (שלב 2.4) או צבירת הבא (שלב 2.10). מאז מבשר הידרוג פתרון PEGDM הוא נוזל, תאים נוטים להתיישב לפני crosslinking היווצרות הידרוג'ל. אם ליישוב צפויה להתרחש במהירות, כגון עם אגרגטים גדולים יותר, זה עשוי להיות מועיל כדי לייצר את הידרוג בשני שלבים, כך התאים ליישב למישור המרכזי של הג'ל. צעד אחד סינתזה הידרוג הליך מתאים תאים מפוזרים מוצג (איור 2) ואת הליך בן שני שלבים מוצג היטב (איור 3) ו המפורטים להלן (3.2-3.9). יצירת כלי שבו הידרוג תוקם על ידי חיתוך קצה נמוגו של מזרק פלסטיק 1 מ"ל ו הצבתו לפתוח בסופו של דבר במעמד. 20 Pipet μL של PEGDM photoactive כךlution אל הקצה הפתוח של המזרק על הבוכנה לוודא נפח מכסה את פני הבוכנה כולה. התאם את הבוכנה במרווחים קטנים על מנת להשיג משטח שטוח נוזל. מניחים את pipet במעמד ולמקם את מתלה מתחת מנורת UV (365nm, ~ 7 mW / cm 2) למשך כ 8 דקות, כדי לאפשר crosslinking הידרוג'ל. במהלך תקופה זו, הכנה של תאים עשויה להיות החל נפח Pipet המכיל את המספר הרצוי של תאים / אגרגטים לתוך צינור 1.8 microcentrifuge מ"ל, כובע, ו צנטריפוגות התחתית 130 גרם במשך 5 דקות. שימוש micropipettor, להסיר בזהירות את התקשורת מבלי להפריע לתא גלולה בקצה הצינור. כאשר ראש התקשורת מתקרב גלולה, זה עשוי להיות מועיל להשתמש עדינה, 10 טיפ pipet μL. בעדינות resuspend התא גלולה ב 20 μL של פתרון photoactive PEGDM (משתמש קצה פעורת פה pipet אם עובדים עם אגרגטים) ולהוסיף את ההשעיה התא המזרק על גבי הדואר crosslinked בעבר חלק הידרוג'ל. לחשוף את המזרק עד 8 דקות נוספות של אור UV להשלים את הבנייה של הידרוג. בסיום, התאים צריכים להיות במארז מלא בתוך הידרוג גלילית (איור 3). הוצא את הידרוג מן המזרק לתוך 1 מ"ל של HBSS היטב הצלחת 24 באר בקצרה לשטוף את הג'ל. מעבירים את הג'ל על 1 מ"ל של התקשורת גם הצלחת 24 באר ותרבות בתנאים הרצוי. 4. היפוקסיה מעקב בשלב כלשהו במהלך התמונה תרבות, התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר תחילת איתות hypoxic. תלוי מה נעשה הדמיה ניתן התמונה צלחת רב היטב או להעביר את הג'ל אל המיקרוסקופ שקופית לפני ההשמה על הבמה מיקרוסקופ. עירור שיא של Ds האדום מושגת ב 556nm ופליטה השיא מתרחש 586nm. פליטה חזקה למדי ולכן photobleaching לא היה observאד להיות בעייתי. זמן השהיה בין תחילת ייצור החלבון וזיהוי האות הראשונה היא כ 12 שעות. אות הוא ספציפי מספיק כדי לזהות תאים איתות בודדים, אבל ההחלטה עשויה להיות מספקת לצורך קביעת לוקליזציה אותות תאיים. בתאים איתות, אות הוא נצפה בדרך כלל בצורה אחידה בכל בציטופלסמה. עוצמת האות ניתן גם להגדיל את החשיפה המורחבת היפוקסיה, למרות שאנחנו עדיין לא נקבע באופן מלא אם זה נובע ביטוי חלבון מוגברת, הצטברות חלבון הכוללת, או חלבון התבגרות מאוחרת. 5. נציג תוצאות למשל נציג MIN6 אגרגטים הגלום הידרוג PEG מוצגת באיור 4. ג'ל crosslinked יהיה מוצק לאורך, לוקח את הצורה של הכלי שבו התגובה בוצעה. ג'ל עם המשטחים החיצוניים חלקים עדיפה להשתלה כדי לסייע למניעת מחדש גוף זרsponse. בתוך הג'ל, אגרגטים התא צריך להיות סגור לגמרי במטריצה ​​ומופץ homogenously כדי לאפשר תחבורה מזין יותר. תמונות נציג איתות hypoxic ב MIN6 אגרגטים הם בתמונה באיור 5. זהים MIN6 אגרגטים נגוע בווירוס סמן היו בתרבית או 20% O 2 (5 א) או 1% O 2 (5 ב) עבור 44 שעות לפני לכידת תמונה. באיור 1. סכמטי של פעילות של מערכת סמן היפוקסיה שלנו. הכניסה adenoviral של האדום Ds DR גנים האמרגן הזרם HRE מאפשר ייצור היפוקסיה-Induced של חלבון פלואורסצנטי תחת שליטה של ​​HIF-1. באיור 2. תרשים זרימה פרוצדורלי אנקפסולציה צעד יחיד של התפזרו MIN6 תאים CRosslinked הידרוג PEGDM. עבור כל ג'ל, התאים מפוזרים הם תלויים 40μL של הפתרון PEGDM photoactive macromer. זה ממוקם מזרק 1mL ערופה לבין הידרוג נוצר תחת אור UV 365nm לאחר 10-12 דקות. בסיום, הדיסק הידרוג יוסר המזרק, שטף והניח בצלחת בינוני מלא גם עבור הדגירה. באיור 3. תרשים זרימה פרוצדורלי אנקפסולציה כפול צעד של MIN6 התאים מצטברים הידרוג PEGDM crosslinked. עבור ג'ל כל חצי ג'ל נוצר לראשונה על ידי crosslinking UV של 20μL של הפתרון PEGDM macromer photoactive במשך 8 דקות. MIN6 אגרגטים מושעים בקפידה 20μL נוספת של פתרון photoactive macromer אשר מתווסף על גבי ג'ל וחצי מראש יצרו. הג'ל מלא נוצרת על ידי 8 דקות נוספות של חשיפה UV עם אגרגטים במארז מלא המדיאלימטוס של הג'ל. איור 4. מקדימה של הידרוג 40μL בהגדלה 20X. MIN6 אגרגטים (~ 400,000 תאים בסך הכל) נראים בבירור בתוך הג'ל. קוטר Hydrogel הוא כ 6 מ"מ (בר = 1mm). איור 5. היפוקסיה פלורסנט איתות MIN6 התאים מצטברים הידרוג PEGDM. תאים שהיו במארז והניח אז הדגירה 20% O 2 במשך 44 שעות לא יוצגו איתות היפוקסיה (א) תוך התאים היו ארוזים אז מודגרות ב 2% O 2 במשך 44 שעות להציג איתות ברור, בכל מקום. (בר = 100μm) (ב).

Discussion

השיטה המוצגת כאן מציעה שיטה מהירה ופשוטה אנקפסולציה תא הידרוג PEG עם שימוש מינימלי ללא תנאים פיזיולוגיים. PEG מהווה חומר אנקפסולציה מאוד שימושי עבור biocompatibility שלה וקלות שינוי. וריאציה פשוטה של ​​אחוז PEG בפתרון photoactive, למשל, ניתן להשתמש כדי להתאים את תכונות מכניות, כגון מודולוס דחיסה, ומאפיינים הובלה באמצעות גודל הנקבוביות. כמו כן, PEG הוא לשנות בקלות על ידי תוספת של שרשראות צד. הידרוג PEG, אם כן, מייצגים הן מכשיר קליני מבטיח פלטפורמה גמישה עבור במבחנה מחקר

שיטה למעקב אחר היפוקסיה ב-PEG הגלום בתאים יש גם הציג. שיטה זו שימושית עבור הפשטות של זיהוי היפוקסיה ועל נמנע הצורך להקריב את התאים של עניין. הטכניקה ניתן ליישם במגוון רחב של סוגי תאים מגוון רחב של מצבים שהופך אותנו שלהefulness רחב. למשל, היפוקסיה כרמז על התמיינות בתאי גזע עשוי להיות במעקב בתא תרבויות גזע micromass. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת רק כדי לפזר מערכות תא או מערכת שבה פזורים תאים מצטבר מאוחר יותר. כמו כן, זיהוי של אות ניאון עלול להיות קשה ברקמות גדול יותר או צפופים.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
Methacrylic Anhydride	Sigma-Aldrich	276685-100ML
Microwave	Emerson	MW8784SB
Vortexer	Scientific Industries	SI-A236
Methylene Chloride	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	346136-1L
Dialysis Tubing	Spectrum	132640
	Laboratories
Freezer
Lyophilizer	Labconco	7670521
Vacuum pump	Welch	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21-022-CV
Syringe Filter	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	*custom formulation
FBS	PAA Laboratories	A15-351
Penicillin-Streptomycin	Mediatech	30-002-CI
Amphotericin B	Mediatech	30-003-CF
Incubator	Thermo Scientific	3597	Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression
Trypsin EDTA	Mediatech	25-052-CI
Orbital Shaker	VWR	12620-926
UV Lamp	Sanyo Denri	FLR40SBLB/M	Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs
Centrifuge	Eppendorf	5811 000.010*	*order number.  Model 5810 R
Microscope	Nikon	TI-ND6-PFS	With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission