Um método para a foto de encapsulamento de células em um hidrogel reticulado PEG é descrito. Sinalização hipóxico dentro insulinoma murino encapsulado (MIN6) agregados é monitorado usando um sistema de marcador fluorescente. Este sistema permite o exame de série de células dentro de um hidrogel andaime e correlação de sinalização hipóxico com as mudanças no fenótipo celular.
Em Diabetes mellitus tipo 1, a destruição auto-imune do pâncreas β-células resulta em perda de produção de insulina e hiperglicemia potencialmente letal. Como uma alternativa ao tratamento com injeção de insulina exógena, o transplante de tecido pancreático funcional tem sido explorado 1,2. Esta abordagem oferece a promessa de uma forma mais natural, a restauração a longo prazo de normoglicemia. Proteção do tecido do doador a partir do sistema imune do hospedeiro é necessário para evitar a rejeição e encapsulamento é um método usado para ajudar a atingir este objectivo.
Materiais biologicamente derivados, como o alginato de agarose 3 e 4, têm sido a escolha tradicional para a construção da cápsula, mas pode induzir inflamação ou fibrose overgrowth 5, que podem impedir o transporte de nutrientes e oxigênio. Alternativamente, sintético poli (etileno glicol) (PEG) com base em hidrogéis são não-degradante, facilmente funcionalizados, disponível em alta pureza,têm tamanho dos poros controlável, e são extremamente biocompatível, 6,7,8. Como um benefício adicional, hidrogéis PEG pode ser formado rapidamente em uma reação de reticulação foto simples que não requer a aplicação de não-fisiológicos temperaturas 6,7. Tal procedimento é descrito aqui. Na reação de reticulação, degradação UV do fotoiniciador, 1 – [4 – (2-hidroxietoxi)-fenil]-2-hidroxi-2-metil-1-propano-1-one (IRGACURE 2959), produz radicais livres que atacam o vinil ligações carbono-carbono dupla de dimethacrylated crosslinking induzindo PEG (PEGDM) na cadeia termina. Reticulação pode ser alcançado em 10 minutos. Hidrogéis PEG construída de tal forma têm se mostrado favoráveis de células 7,9, ea concentração fotoiniciador baixa e uma breve exposição à radiação UV não é prejudicial à viabilidade e função do tecido encapsulado 10. Enquanto nós metacrilato nosso PEG com o método descrito abaixo, PEGDM também pode ser dirrectamente comprado de fornecedores como a Sigma.
Uma conseqüência do encapsulamento é o isolamento das células de uma rede vascular. Fornecimento de nutrientes, nomeadamente de oxigênio, é reduzida e limitada por difusão. Esta disponibilidade de oxigênio reduzida pode especialmente impacto β-células, cuja função secretora de insulina é altamente dependente de oxigênio 11-13. Composição da cápsula e geometria também terá impacto taxas de difusão e comprimentos de oxigênio. Portanto, nós também descrevem uma técnica para identificar as células hipóxicas dentro de cápsulas nosso PEG. Infecção das células com um adenovírus recombinante permite um sinal fluorescente a ser produzido quando intracelular fator induzível por hipóxia (HIF) vias são ativadas 14. Como HIFs são os principais reguladores da resposta transcricional a hipóxia, eles representam um marcador de alvo ideal para a detecção de hipóxia sinalização 15. Esta abordagem permite a detecção mais fácil e rápida de hypoxic células. Resumidamente, o adenovírus tem a seqüência de uma proteína fluorescente vermelha (Red Ds DR de Clontech) sob o controle de um elemento de hipóxia-responsivos (HRE) trímero. Estabilização do HIF-1 por condições de baixo oxigênio irá conduzir a transcrição da proteína fluorescente (Figura 1). Detalhes adicionais sobre a construção desse vírus têm sido publicados anteriormente 15. O vírus é armazenado em glicerol 10% a -80 ° C como muitos 150 mL alíquotas em 1,5 mL tubos de centrífuga em uma concentração de 3,4 x 10 10 PFU / mL.
Estudos anteriores em nosso laboratório mostraram que MIN6 células encapsuladas como agregados manter a sua viabilidade ao longo de 4 semanas de cultura em 20% de oxigênio. MIN6 agregados cultivadas em 2 ou 1% de oxigênio mostrou dois sinais de células necróticas (ainda cerca de 85-90% viável) através da coloração com brometo de etídio, bem como alterações morfológicas em relação às células de oxigênio 20%. A forma lisa esférica dos agregados exibido em 20% foi lost e agregados apareceu mais como grupos desorganizados de células. Enquanto a tensão de oxigênio não causar uma queda acentuada da viabilidade, é claramente impactando MIN6 agregação e funcionar como medida pela glicose estimulada a secreção de insulina 15. Ocidental blot de células encapsuladas em 20% e 1% de oxigênio também mostrou um aumento significativo na HIF-1α em células cultivadas em condições de baixo oxigênio que se correlaciona com a expressão da proteína DsRed DR.
O método aqui apresentado oferece uma técnica rápida e simples para encapsulamento de células em um hidrogel PEG com uso mínimo de condições não fisiológicas. PEG representa um material de encapsulação muito útil para a sua biocompatibilidade e facilidade de modificação. Simples variação de porcentagem de PEG na solução fotoativo, por exemplo, pode ser usado para ajustar as propriedades mecânicas, como módulo de compressão, e propriedades de transporte através do tamanho dos poros. Além disso, PEG é facilmente modificado pela adição de cadeias laterais. Hidrogéis PEG, portanto, representar tanto um dispositivo promissor clínica e uma plataforma flexível para investigação in vitro
Um método para rastreamento de hipóxia em PEG-encapsulado células também tem sido apresentado. Este método é útil para a simplicidade da detecção de hipóxia e para evitar a necessidade de sacrificar as células de interesse. A técnica pode ser aplicada a uma variedade de tipos de células em uma variedade de condições de fazer a sua nosefulness amplo. Por exemplo, a hipóxia como uma dica para a diferenciação de células-tronco podem ser controladas em culturas de células-tronco Micromass. No entanto, este método só pode ser aplicada para dispersar sistemas de célula ou sistema no qual as células são dispersos depois agregadas. Além disso, a detecção do sinal fluorescente pode ser difícil em tecidos maiores ou mais densas.
The authors have nothing to disclose.
Graças à Anseth Kristi laboratório da Universidade de Colorado, Boulder para generosamente fornecer MIN6 células. Financiamento para este projeto foi fornecido pela NSF.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional |
PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
Microwave | Emerson | MW8784SB | |
Vortexer | Scientific Industries | SI-A236 | |
Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
Laboratories | |||
Freezer | |||
Lyophilizer | Labconco | 7670521 | |
Vacuum pump | Welch | 8917Z-01 | |
Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
HBSS | Mediatech | 21-022-CV | |
Syringe Filter | VWR | 28145-477 | |
RPMI 1640 | Mediatech | * | *custom formulation |
FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
Amphotericin B | Mediatech | 30-003-CF | |
Incubator | Thermo Scientific | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
Trypsin EDTA | Mediatech | 25-052-CI | |
Orbital Shaker | VWR | 12620-926 | |
UV Lamp | Sanyo Denri | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
Microscope | Nikon | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |