En metode til foto-indkapsling af celler i en krydsbundet PEG hydrogel er beskrevet. Hypoxisk signalering inden indkapslet murine insulinom (MIN6) aggregater er sporet ved hjælp af et fluorescerende markør system. Dette system giver mulighed for seriel undersøgelse af celler i en hydrogel stillads og korrelation på hypoksisk signalering med ændringer i celle fænotype.
I Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruktion af pancreas β-celler resulterer i tab af insulin produktion og potentielt dødelige hyperglykæmi. Som en alternativ behandlingsmulighed til eksogen insulin injektion, er transplantation af funktionelle bugspytkirtlen væv er blevet udforsket 1,2. Denne fremgangsmåde giver løfte om en mere naturligt, langsigtet genopretning af normoglycemia. Beskyttelse af donor væv fra værtens immunsystem er nødvendig for at forhindre afstødning og indkapsling er en metode, der anvendes til at bidrage til at nå dette mål.
Biologisk-afledte materialer, såsom alginat 3 og agarose 4, har været det traditionelle valg til kapsel konstruktion, men kan fremkalde inflammation eller fibrose overvækst 5, der kan hindre næringsstoffer og ilt transport. Alternativt, syntetiske poly (ethylen glycol) (PEG)-baseret hydrogeler er ikke-nedværdigende, let funktionaliserede, som findes på høj renhed,har kontrollerbar porestørrelse, og er ekstremt biokompatible, 6,7,8. Som en ekstra fordel, kan PEG hydrogeler dannes hurtigt i et enkelt foto-crosslinking reaktion, der ikke kræver anvendelse af ikke-fysiologiske temperaturer 6,7. En sådan procedure er beskrevet her. I crosslinking reaktion, UV nedbrydning af fotoinitiator, 1 – [4 – (2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propan-1-on (Irgacure 2959), producerer frie radikaler, der angriber vinyl carbon-carbon-dobbeltbindinger af dimethacrylated PEG (PEGDM) inducerende crosslinking på kæden ender. Crosslinking kan opnås inden for 10 minutter. PEG hydrogeler konstrueret på en sådan måde, har vist sig positivt støtte celler 7,9, og den lave fotoinitiator koncentration og kortvarig udsættelse for UV-bestråling ikke er til skade for levedygtighed og funktion af de indkapslede væv 10. Mens vi methacrylat vores PEG med den metode, der er beskrevet nedenfor, kan PEGDM også dirgenvindes direkte købes fra leverandører som Sigma.
En naturlig konsekvens af indkapsling er isolation af celler fra en vaskulær netværk. Levering af næringsstoffer, især ilt, er derfor reduceret og begrænset af diffusion. Dette reducerede ilt tilgængelighed kan især betydning β-celler, hvis insulin sekretorisk funktion er meget afhængig af ilt 11-13. Capsule sammensætning og geometri vil også påvirke diffusion priser og længder for ilt. Derfor har vi også beskrive en teknik til at identificere hypoxisk celler inden for vores PEG kapsler. Infektion af cellerne med et rekombinant adenovirus giver mulighed for en fluorescerende signal, der skal produceres, når intracellulære hypoxi-inducerende faktor (HIF) veje aktiveres 14. Da HIFs er de primære regulatorer af transkriptionel respons på hypoxi, de repræsenterer et ideelt mål markør til påvisning af hypoxisk signalering 15. Denne fremgangsmåde giver mulighed for nem og hurtig detektion af hypoxic celler. Kortfattet, at adenovirus har sekvens for et rødt fluorescerende protein (Ds Red DR fra Clontech) under kontrol af en hypoxi-responderende element (HRE) trimeren. Stabilisering af HIF-1 ved lavt iltindhold vil drive transskription af den fluorescerende protein (figur 1). Yderligere oplysninger om opførelsen af denne virus er blevet offentliggjort tidligere 15. Den virus er gemt i 10% glycerol ved -80 ° C som mange 150 μL aliquoter i 1,5 ml centrifugeglas ved en koncentration på 3,4 x 10 10 PFU / ml.
Tidligere undersøgelser i vores laboratorium har vist, at MIN6 celler indkapslet som aggregater bevare deres levedygtighed i hele 4 uger af kultur i 20% ilt. MIN6 aggregater kulturperler på 2 eller 1% ilt viste både tegn på nekrotiske celler (stadig ca 85-90% levedygtige) ved farvning med ethidiumbromid samt morfologiske ændringer i forhold til celler i 20% ilt. Den glatte kugleform aggregater vises på 20% var lost og aggregater syntes mere som uorganiserede grupper af celler. Mens den lave ilt-stress ikke er årsag til et markant fald i levedygtighed, er det klart påvirker MIN6 sammenlægning og fungere som målt ved glukose-stimuleret insulinsekretion 15. Western blot analyse af indkapslede celler i 20% og 1% ilt viste også en signifikant stigning i HIF-1α for celler dyrket i den lave ilt-forhold, som korrelerer med udtryk for DsRed DR protein.
Metoden præsenteres her tilbyder en hurtig og enkel teknik til celle indkapsling i en PEG hydrogel med minimal brug af ikke-fysiologiske betingelser. PEG være et meget nyttigt indkapsling materialet til dets biokompatibilitet og nem ændring. Enkel variation af PEG procentdel i fotoaktive løsning, for eksempel kan bruges til at justere mekaniske egenskaber, såsom trykstyrke modulus, og transport egenskaber gennem pore størrelse. Også, PEG let modificeret ved tilsætning af sidekæder. PEG hydrogeler, derfor er både en lovende klinisk enhed og en fleksibel platform for in vitro-forskning
En metode til sporing hypoxi i PEG-indkapslede celler er også blevet præsenteret. Denne metode er nyttig for enkelheden i hypoxi opdagelse og for at undgå behovet for at ofre cellerne af interesse. Teknikken kan anvendes på en række forskellige typer af celler i en række betingelser, der gør sit osefulness bred. For eksempel kan hypoxi som et kriterium til stamceller differentiering spores i stamcelle micromass kulturer. Imidlertid kan denne metode kun blive anvendt til at sprede celle systemer eller system, hvor spredte celler senere aggregeres. Desuden kan detektion af fluorescerende signal være vanskeligt i større eller mere fintmasket væv.
The authors have nothing to disclose.
Takket være Kristi Anseth Lab ved University of Colorado, Boulder for generøst at levere MIN6 celler. Finansieringen af dette projekt har været leveret af NSF.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional |
PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
Microwave | Emerson | MW8784SB | |
Vortexer | Scientific Industries | SI-A236 | |
Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
Laboratories | |||
Freezer | |||
Lyophilizer | Labconco | 7670521 | |
Vacuum pump | Welch | 8917Z-01 | |
Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
HBSS | Mediatech | 21-022-CV | |
Syringe Filter | VWR | 28145-477 | |
RPMI 1640 | Mediatech | * | *custom formulation |
FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
Amphotericin B | Mediatech | 30-003-CF | |
Incubator | Thermo Scientific | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
Trypsin EDTA | Mediatech | 25-052-CI | |
Orbital Shaker | VWR | 12620-926 | |
UV Lamp | Sanyo Denri | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
Microscope | Nikon | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |