En metod för foto-inkapsling av celler i en tvärbunden PEG hydrogel beskrivs. Hypoxiska signalering inom inkapslade murina insulinoma (MIN6) aggregat är spåras med hjälp av en fluorescerande markör system. Detta system möjliggör seriell undersökning av celler i en hydrogel klätterställning och korrelation av hypoxiska signalering med förändringar i cellernas fenotyp.
I Diabetes mellitus typ 1, autoimmun destruktion av bukspottkörtelns β-celler resulterar i förlust av insulinproduktionen och potentiellt dödliga hyperglykemi. Som ett alternativ behandling alternativ för att tillföra insulin injektion måste transplantation av funktionella bukspottkörtelns vävnad undersökts 1,2. Detta tillvägagångssätt ger löfte om en mer naturlig och långsiktig restaurering av normoglycemia. Skydd av givare vävnad från värdens immunsystem krävs för att förhindra avstötning och inkapsling är en metod som används för att bidra till att uppnå detta mål.
Biologiskt framställda material såsom alginat 3 och agaros 4, har varit det traditionella valet för kapsel konstruktion men kan framkalla inflammation eller fibrotiska överväxt fem som kan hindra näringsämnen och syre transport. Alternativt, syntetiska poly (etylenglykol) (PEG)-baserade hydrogeler är icke-kränkande, lätt functionalized, som finns på hög renhet,har kontrollerbar porstorlek, och är mycket biokompatibla, 6,7,8. Som en ytterligare fördel, får PEG hydrogeler bildas snabbt i en enkel foto-crosslinking reaktion som inte kräver användning av icke-fysiologiska temperaturer 6,7. Ett sådant förfarande beskrivs här. I crosslinking reaktion UV-nedbrytning av fotoinitiator, 1 – [4 – (2-hydroxietoxi)-fenyl]-2-hydroxi-2-metyl-1-propan-1-en (Irgacure 2959), producerar fria radikaler som angriper vinyl kol-kol dubbelbindningar i dimethacrylated PEG (PEGDM) inducerande crosslinking på kedjans ändar. Crosslinking kan uppnås inom 10 minuter. PEG hydrogeler konstruerade på ett sådant sätt har visat sig gynnsamt stödjeceller 7,9, och den låga fotoinitiator koncentration och kortvarig exponering för UV-strålning inte är skadligt för livskraft och funktion av inkapslade vävnaden 10. Medan vi metakrylat våra PEG den metod som beskrivs nedan kan PEGDM också dirrekt köps från leverantörer som Sigma.
En naturlig konsekvens av inkapsling är isolering av celler från en vaskulär nätverk. Tillförsel av näringsämnen, särskilt syre, därför minskas och begränsas av diffusion. Detta minskade syre tillgänglighet kan framför allt påverka β-celler vars insulin sekretoriska funktion är starkt beroende av syrgas 11-13. Kapsel sammansättning och geometri kommer också att påverka spridning priser och längder för syre. Därför beskriver vi också en teknik för att identifiera hypoxiska celler inom vår PEG kapslar. Infektion i celler med rekombinant adenovirus tillåter en fluorescerande signal som skall produceras när intracellulär hypoxi-inducerbara faktorer (HIF) vägar aktiveras 14. Som HIFs är den primära tillsynsmyndigheter om de transkriptionell svar på hypoxi, utgör de ett perfekt mål markör för detektion av hypoxisk signalering 15. Detta tillvägagångssätt möjliggör enkel och snabb upptäckt av hypoxiC celler. Kortfattat har adenovirus sekvensen för ett rött fluorescerande protein (Ds Red Dubbelrum från Clontech) under kontroll av en hypoxi-känslig element (HRE) trimerer. Stabilisering av HIF-1 av låga syreförhållanden kommer att driva transkription av det fluorescerande protein (Figur 1). Ytterligare detaljer om byggandet av detta virus har publicerats tidigare 15. Viruset sparas i 10% glycerol vid -80 ° C så många 150 mikroliter portioner i 1,5 tuber ml centrifugera vid en koncentration av 3,4 x 10 10 PFU / mL.
Tidigare studier i vårt labb har visat att MIN6 celler inkapslade som aggregat bibehålla sin livskraft i hela 4 veckor kultur i 20% syre. MIN6 aggregat odlade på 2 eller 1% syre visade båda tecken på nekrotiska celler (fortfarande ca 85-90% viabla) genom färgning med etidiumbromid samt morfologiska förändringar i förhållande till celler i 20% syre. Den släta sfäriska formen av aggregaten visas på 20% var lost och aggregat verkade mer som oorganiserad grupp av celler. Medan låga syre stressen inte orsakar en markant nedgång i lönsamheten, är det påverkar helt klart MIN6 aggregering och funktion mätt med glukos-stimulerad insulinsekretion 15. Western blot analys av inkapslade celler i 20% och 1% syre visade också en betydande ökning av HIF-1α för cellerna odlas i låga syreförhållanden som korrelerar till uttryck av DsRed DR protein.
Den metod som presenteras här ger en snabb och enkel teknik för cell inkapsling i en PEG hydrogel med minimal användning av icke-fysiologiska förhållanden. PEG är en mycket användbar inkapsling material för sin biokompatibilitet och enkel modifiering. Enkel variant av PEG procentsats i fotoaktiva lösning, till exempel, kan användas för att justera mekaniska egenskaper, såsom tryck-modul och egenskaper transport genom porstorlek. Dessutom är PEG lätt modifieras genom tillsats av sidokedjor. PEG hydrogeler därför är både en lovande klinisk enhet och en flexibel plattform för in vitro-forskning
En metod för spårning av hypoxi i PEG-inkapslade celler har också lagts fram. Denna metod är användbar för enkelheten i hypoxi upptäckt och för att undvika behovet av att offra cellerna av intresse. Tekniken kan tillämpas på en mängd olika typer av celler i en rad olika tillstånd att göra sina ossefulness bred. Till exempel kan hypoxi som en kö för stamceller differentiering spåras i micromass stamceller kulturer. Dock kan denna metod endast användas för att skingra cell-system eller system där spridda celler senare läggs samman. Dessutom kan detektion av fluorescerande signalen vara svårt i större eller tätare vävnader.
The authors have nothing to disclose.
Tack vare Kristi Anseth labb vid University of Colorado, Boulder för generöst leverera MIN6 celler. Finansieringen för detta projekt har lämnats av NSF.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional |
PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
Microwave | Emerson | MW8784SB | |
Vortexer | Scientific Industries | SI-A236 | |
Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
Laboratories | |||
Freezer | |||
Lyophilizer | Labconco | 7670521 | |
Vacuum pump | Welch | 8917Z-01 | |
Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
HBSS | Mediatech | 21-022-CV | |
Syringe Filter | VWR | 28145-477 | |
RPMI 1640 | Mediatech | * | *custom formulation |
FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
Amphotericin B | Mediatech | 30-003-CF | |
Incubator | Thermo Scientific | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
Trypsin EDTA | Mediatech | 25-052-CI | |
Orbital Shaker | VWR | 12620-926 | |
UV Lamp | Sanyo Denri | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
Microscope | Nikon | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |