גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים
Summary
אנו מתארים באמצעות פרוטוקול המוךפו"גנטי שהולך העצם חלבונים 7 (BMP-7) או Matrigel סלקטיבי לגרום לצמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים העיקריים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של חולדות הלידה.
Abstract
הצורה של הדנדריטים ארבור קובע את הקלט הסינפטי הכולל תא עצב יכול לקבל 1-3, ומשפיע סוגי והפצה של תשומות אלה 4-6. דפוסי שינה של צמיחה הפלסטיות דנדריטים והן קשורות עם תפקוד לקוי neurobehavioral במודלים ניסיוניים 7, והם חשבו לתרום סימפטומים קליניים שנצפה בשתי 8-10 הפרעות התפתחותיות ומחלות ניווניות 11-13. תצפיות אלו מדגישים את החשיבות התפקודית של ויסות בדיוק מורפולוגיה הדנדריטים, וסבורים כי מנגנוני זיהוי השולטים הצמיחה הדנדריטים לא רק לקדם את ההבנה של כמה עצבי קישוריות מוסדר במהלך התפתחות תקינה, אבל עשויה גם לספק תובנות על אסטרטגיות טיפולית חדשנית למחלות נוירולוגיות שונות.
מחקרים שיבדקו את המנגנונים של צמיחת הדנדריטים יהיה להקל במידה רבה על ידי זמינות Ofa מערכת מודל המאפשר נוירונים כדי לפעול באופן ניסיוני ממצב שבו הם לא להאריך דנדריטים אחד שבו הם לפרט ארבור הדנדריטים דומה לזה של עמיתיהם שלהם vivo. תרבויות העיקריות של נוירונים אוהדים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של מכרסמים סביב הלידה לספק מודל כזה. כאשר בתרבית מוגדר בינוני בהעדר מתאי גליה בסרום ו ganglionic, הנוירונים אוהדים להאריך את תהליך יחיד אשר axonal, ואת זה המדינה חד קוטבי נמשכת שבועות עד חודשים בתרבות 14,15. עם זאת, תוספת של המוךפו"גנטי שהולך או עצם חלבונים 7 (BMP-7) 16,17 או 18 Matrigel עד בינוני התרבות מפעילה נוירונים אלה כדי להרחיב את התהליכים רבים העונים על קריטריונים מורפולוגיים, ביוכימיים ופונקציונלי של דנדריטים. נוירונים אוהדים הסתייגותם מן SCG של מכרסמים סביב הלידה ו שגודלו בתנאים מוגדרים הם אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים 19שמגיבים בצורה אחידה לפעילות דנדריט, קידום של Matrigel, BMP-7 ו BMPs אחרים של decapentaplegic (DPP) ו 60A subfamilies 17,18,20,21. חשוב לציין, Matrigel-BMP ו-Induced דנדריט היווצרות מתרחשת בהיעדר שינויים הישרדות התא או צמיחה axonal 17,18.
כאן, נתאר כיצד להגדיר את תרבויות הסתייגותם של נוירונים אוהדים הנגזרות SCG של חולדות סביב הלידה, כך שהם מגיבים על פעילות דנדריט, קידום סלקטיבי של Matrigel או BMPs.
Protocol
Discussion
היתרונות של מודל זה הם: (א) תרבויות מורכבות של אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים אוהדים חסרי סוגי תאים אחרים 17,23 (ב) גורם הגדילה הדרישות של נוירונים הם אוהדים מבוססת היטב, אשר מאפשר את השימוש בינוני מוגדר, וכן מגוון של כלי התקשורת מוגדרים, מצעים לעבוד היטב לגידול ושמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מן המכון הלאומי לבריאות (מענקים R21 ו R01 NS45037 ES014901).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | Gibco | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | Becton Dickinson | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Bioproducts | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberg Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Prolong Antifade kit Molecular Probes | P7481 |
Table 1. Materials.
References
- Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. . The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
- Purves, D. . A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).
- Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
- Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
- Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
- Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
- Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
- Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
- Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
- de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
- Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
- Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
- Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
- Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
- Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
- Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).
- Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
- Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).
