Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas
Summary
Se describe un protocolo para el uso de la proteína morfogenética ósea-7 (BMP-7) o Matrigel para inducir de manera selectiva el crecimiento dendrítico en la enseñanza primaria neuronas simpáticas disociadas de los ganglios cervical superior (SCG) de las ratas perinatales.
Abstract
La forma de la dendrítica cenador determina el total de entrada sináptica una neurona puede recibir 1-3, e influye en los tipos y la distribución de estas entradas 4-6. Alteración de los patrones de crecimiento dendrítico y la plasticidad se asocia con alteración de la función neuroconductual en modelos experimentales, 7, y se cree que contribuyen a los síntomas clínicos observados en los dos 8-10 trastornos del desarrollo neurológico y enfermedades neurodegenerativas 11-13. Estas observaciones ponen de relieve la importancia funcional de, precisamente, la regulación de la morfología dendrítica, y sugieren que la identificación de los mecanismos que controlan el crecimiento dendrítico no sólo avanzar en la comprensión de cómo la conectividad neuronal está regulada durante el desarrollo normal, pero también puede dar una idea de nuevas estrategias terapéuticas para diversas enfermedades neurológicas.
Estudios sobre el mecanismo de crecimiento dendrítico se vería enormemente facilitada por la disponibilidad oFA modelo de sistema que permite que las neuronas de forma experimental pasó de un estado en el que no se extienden a las dendritas de aquel en el que la elaboración de un jardín dendríticas comparable a la de sus homólogos en vivo. Los cultivos primarios de neuronas simpáticas disociadas de los ganglios cervical superior (SCG) de roedores perinatales proporcionar ese modelo. Cuando se cultiva en un medio definido en la ausencia de células gliales de suero y ganglionar, las neuronas simpáticas extender un único proceso que es axonal, y este estado unipolar persiste durante semanas o meses en cultivo 14,15. Sin embargo, la adición de proteína morfogenética ósea-7 (BMP-7) o 16,17 Matrigel 18 al medio de cultivo desencadena estas neuronas para extender múltiples procesos que cumplen los criterios morfológicos y bioquímicos y funcionales para dendritas. Las neuronas simpáticas disociadas de la SCG de los roedores perinatales y cultivadas bajo condiciones definidas son una población homogénea de las neuronas 19que respondan de manera uniforme a la actividad de las dendritas se promociona de Matrigel, BMP-7 y otras BMPs de la decapentaplegic (DPP) y 60A subfamilias 17,18,20,21. Es importante destacar que Matrigel y BMP-inducida dendrita formación se produce en ausencia de cambios en la supervivencia de las células o el crecimiento axonal 17,18.
Aquí se describe cómo configurar cultivos disociados de neuronas simpáticas derivadas de la SCG perinatales de las ratas para que sean sensibles a los selectivos de la dendrita de promoción de la actividad de Matrigel o BMP.
Protocol
Discussion
Las ventajas de este modelo incluyen: (a) los cultivos se compone de una población homogénea de las neuronas simpáticas desprovistos de otros tipos de células 17,23; (b) los requisitos del factor de crecimiento de las neuronas simpáticas son bien establecido, que permite el uso de un medio definido, y una variedad de medios definidos, y sustratos funcionan bien para el cultivo y el mantenimiento de las neuronas simpáticas 23, (c) las neuronas en estos cultivos responder de manera uniforme a l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (subvenciones R21 NS45037 y ES014901 R01).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | Gibco | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | Becton Dickinson | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Bioproducts | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberg Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Prolong Antifade kit Molecular Probes | P7481 |
Table 1. Materials.
References
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