Fremkalde dendritisvækst i dyrkede sympatiske neuroner
Summary
Vi beskriver en protokol til anvendelse knoglemorfogenetisk protein-7 (BMP-7) eller Matrigel til selektivt at inducere dendritisk vækst i primære sympatiske neuroner adskilles fra superior cervikale ganglier (SCG) med perinatal rotter.
Abstract
Formen af dendritiske savakslen bestemmer den samlede synaptiske input en neuron kan modtage 1-3, og påvirker arten og fordelingen af disse indgange 4-6. Ændrede mønstre i dendritisk vækst og plasticitet er forbundet med nedsat neurobehavioral funktion i eksperimentelle modeller 7, og menes at bidrage til de kliniske symptomer observeret hos begge nervesystemets 8-10 og neurodegenerative sygdomme 11-13. Sådanne observationer understrege funktionelle vigtigheden af netop at regulere dendritisk morfologi, og tyder på, at identificere mekanismer, der styrer dendritisvækst ikke kun vil fremme forståelsen af, hvordan neuronal tilslutningsmuligheder reguleres under normal udvikling, men kan også give indsigt i nye terapeutiske strategier for forskellige neurologiske sygdomme.
Mekanistiske studier af dendritisvækst vil blive lettet betydeligt af tilgængeligheden oFA model system, der tillader neuroner kan eksperimentelt skiftet fra en tilstand, hvor de ikke strækker dendritter til én, hvor de udarbejde et dendritisk lysthus kan sammenlignes med deres in vivo modstykker. Primære kulturer af sympatiske neuroner dissocierede fra superior cervikale ganglier (SCG) med perinatal gnavere tilvejebringe en sådan model. Når de dyrkes i defineret medium i fravær af serum og ganglie gliaceller, sympatiske neuroner strækker en enkelt proces, som er axonal, og dette unipolære tilstand vedvarer i uger til måneder i kultur 14,15. Imidlertid er tilsætningen af enten knoglemorfogenetisk protein-7 (BMP-7) 16,17 eller Matrigel 18 til dyrkningsmediet udløser disse neuroner til at udvide flere processer, som opfylder de morfologiske, biokemiske og funktionelle kriterier for dendritter. Sympatiske neuroner dissocierede fra SCG af perinatale gnavere og dyrket under definerede betingelser er en homogen population af neuroner 19at reagere ensartet på dendritceller-fremmende aktivitet af Matrigel, BMP-7 og andre BMP'er i decapentaplegic (DPP) og 60A underfamilier 17,18,20,21. Vigtigt, Matrigel-og BMP-induceret dendritceller dannelse forekommer i fravær af ændringer i cellens overlevelse eller axonal vækst 17,18.
Her beskriver vi, hvordan at etablere dissocierede kulturer af sympatiske neuroner afledt fra SCG af perinatal rotter, således at de reagerer på den selektive dendritceller-fremmende aktivitet af Matrigel eller BMP'er.
Protocol
Discussion
Fordelene ved denne model omfatter: (a) kulturer består af en homogen population af sympatiske neuroner fri for andre celletyper 17,23 (b) de vækstfaktorreceptorer krav sympatiske neuroner er veletableret, som tillader anvendelse af defineret medium, og en række definerede medier og substrater fungere godt til dyrkning og opretholdelse sympatiske neuroner 23 (c) neuroner i disse kulturer reagere ensartet på dendritceller-fremmende aktivitet af Matrigel, BMP-7 og andre BMP'er af DPP og 60A u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet med midler fra National Institutes of Health (tilskud R21 NS45037 og R01 ES014901).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | Gibco | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | Becton Dickinson | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Bioproducts | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberg Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Prolong Antifade kit Molecular Probes | P7481 |
Table 1. Materials.
References
- Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. . The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
- Purves, D. . A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).
- Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
- Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
- Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
- Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
- Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
- Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
- Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
- de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
- Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
- Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
- Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
- Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
- Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
- Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).
- Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
- Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).
