Hier laten we zien ons protocol voor isolatie van basale en submucosale klier kanaal cellen van de muis luchtpijpen. We tonen ook aan de methode van het injecteren van stamcellen in het dorsale muis vetkussentje om een te creëren<em> In vivo</em> Model van submucosale klier regeneratie.
De grote luchtwegen rechtstreeks in contact met de omgeving en dus gevoelig voor schade van toxines en infectieuze agentia die we inademen in 1. De grote luchtwegen vereisen daarom een efficiënt herstelmechanisme ons lichaam beschermen. Dit proces vindt reparatie van stamcellen in de luchtwegen en het isoleren van stamcellen die uit de luchtwegen belangrijk voor het begrijpen van de mechanismen van herstel en regeneratie. Het is ook belangrijk voor het begrijpen van abnormale reparatie die kan leiden tot aandoeningen van de luchtwegen 2. Het doel van deze methode is om een nieuwe stamcelpopulatie isoleren van de muis trachea submucosale klier kanalen en deze cellen plaats in in vitro en in vivo modelsystemen de mechanismen van herstel en regeneratie van de submucosale klieren 3 identificeren. Deze productie toont methoden die kunnen worden gebruikt voor het isoleren en assay het kanaal en basale stamcellen uit de grote luchtwegen 3. Hierdoor kunnen weom ziekten van de luchtwegen, zoals cystische fibrose, astma en chronische obstructieve pulmonaire ziekte te bestuderen. Momenteel zijn er geen methoden voor het isoleren van submucosale klier duct cellen en er zijn geen in vivo modellen voor de regeneratie van submucosale klieren bestuderen.
Deze techniek kanaal en basale cellen van de luchtwegen isolaat belangrijk voor een beter begrip van de luchtwegen en herstel en regeneratie van de luchtwegen. De hier beschreven technieken zijn een paar kritische stappen. De eerste is de geoptimaliseerde enzymatische vertering periode. De tweede is het creëren van een enkele celsuspensie door middel van seriële passage met steeds hogere gage naalden naar cel knippen te voorkomen, maar te breken celklonten. De derde is de FACS analyse en gating van cellen met geschikt…
The authors have nothing to disclose.
We willen de globale Stem Cell Research Center FACS erkennen en vooral Jessica Scholes en Felicia Codrea bedanken voor hun hulp bij celsortering. Het werk werd gefinancierd door CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / COPD Stichting ATS-06-065, The Concern Foundation, De UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / Longkanker SPORE, de Universiteit van Californië kanker Onderzoek Coordinating Committee en de Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).
Name of the reagent | Company | Catalog number |
Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV |
Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 |
Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 |
L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl |
Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI |
Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI |
Amphotericin B (0.25 μg/ ml) | Lonza | 17-836R |
Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 |
Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 |
Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 |
Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 |
Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 |
Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI |
Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 |
Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 |
Table 1. Complete media components.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea.