Isolamento delle cellule basali e sottomucosa cellule del dotto di Gland mouse Trachea
Summary
Qui mostriamo il nostro protocollo per l'isolamento di cellule della ghiandola basali e sottomucoso condotto da trachee del mouse. Abbiamo anche dimostrare il metodo di iniezione di cellule staminali nel cuscinetto di grasso dorsale del mouse per creare un<em> In vivo</emModello> di rigenerazione ghiandola sottomucosa.
Abstract
Grandi vie aeree sono direttamente in contatto con l'ambiente e quindi suscettibile al danno da tossine e agenti infettivi che respiro in 1. Le vie aeree di grandi dimensioni richiedono quindi un meccanismo di riparazione efficace per proteggere i nostri corpi. Questo processo di ripristino si verifica a partire da cellule staminali delle vie aeree e isolare queste cellule staminali delle vie aeree è importante per la comprensione dei meccanismi di riparazione e rigenerazione. E 'anche importante per comprendere riparazione anormale che può portare a malattie delle vie aeree 2. L'obiettivo di questo metodo è quello di isolare una nuova popolazione di cellule staminali da tracheali dotti delle ghiandole topo sottomucosi e di inserire in queste cellule in vitro e in vivo sistemi modello per identificare i meccanismi di riparazione e rigenerazione delle ghiandole della sottomucosa 3. Questa produzione mostra i metodi che possono essere utilizzati per isolare e saggio le cellule staminali condotto e basale del grande vie aeree 3. Questo ci permetteràstudiare le patologie delle vie aeree, come la fibrosi cistica, asma e malattia polmonare ostruttiva cronica. Attualmente, non esistono metodi per l'isolamento delle cellule della ghiandola sottomucosa condotto e non ci sono modelli in vivo per studiare la rigenerazione delle ghiandole della sottomucosa.
Protocol
Discussion
Questa tecnica di isolare cellule del dotto e basale dalle vie aeree è importante per migliorare la nostra comprensione della riparazione e rigenerazione delle vie aeree e malattie delle vie aeree. Le tecniche qui descritte sono a pochi passi critici. Il primo è il periodo ottimizzato digestione enzimatica. Il secondo è la creazione di una sospensione singola cellula tramite seriale passaging con aghi calibro progressivamente più elevate per impedire ghigliottina cella ma per rompere ammassi cellulari. Il terzo è l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere gli indirizzi di massima Stem Cell FACS centro di ricerca e in particolare ringrazio Jessica Scholes e Felicia Codrea per il loro aiuto con la selezione delle cellule. Il lavoro è stato finanziato dal CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / BPCO Fondazione ATS-06-065, la Fondazione preoccupazione, Il toracica UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Oncology Program / Lung Cancer SPORE, l'Università della California Cancer La ricerca e il Comitato di Coordinamento Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI |
| Amphotericin B (0.25 μg/ ml) | Lonza | 17-836R |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 |
Table 1. Complete media components.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea.
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