מדידת תא בודדה של שחרור דופמין במתח-clamp וAmperometry סימולטני
Summary
טכניקת amperometric מודדת שחרור דופאמין מתא בודד על ידי גילוי נוכחי חמצונים המיוצרים על ידי חמצון דופמין ספונטני. מהדק המתח סימולטני ומתודולוגיה amperometry לחשוף את מערכת היחסים בין מכניסטית "הפעילות" הכוללת של טרנספורטר דופאמין ותפקיד הרגולציה של פעילות זו על ההובלה ההפוכה של דופמין.
Abstract
לאחר השחרור ל, דופמין המרווח הסינפטי מפעיל תכונות הביולוגיות שלו דרך יעדיה לפני ואחרי-הסינפטי 1. אות דופמין הוא הופסק על ידי דיפוזיה 2-3, אנזימים תאיים 4, ומובילים בממברנה 5. טרנספורטר דופאמין, הממוקם בחריץ שperi-הסינפטית של הנוירונים דופאמין מנקה את האמינים ישוחררו באמצעות שטף דופמין פנימה (ספיגה). טרנספורטר דופאמין יכול לעבוד גם בכיוון הפוך כדי לשחרר אמינים מבפנים החוצה בתהליך שנקרא תחבורה או זרימה של דופמין 5 כלפי חוץ. . יותר מ 20 שנים לפני זולצר et al דיווח טרנספורטר דופאמין יכול לפעול בשני מצבי פעילות: קדימה (ספיגה) והפוך (זרימה) 5. הנוירוטרנסמיטר משתחרר דרך הזרימה דרך טרנספורטר יכול להזיז כמות גדולה של דופמין למרחב החוץ התאי, והוכח לשחק תפקיד מרכזי בויסות דופמין h התאיomeostasis 6. כאן אנו מתארים כיצד מהדק תיקון זמני והקלטת amperometry יכולים לשמש למדידת דופמין שוחרר באמצעות מנגנון הזרימה עם רזולוצית זמן האלפית השנייה, כאשר פוטנציאל הממברנה נשלט. לשם כך, בהווה ובאותות חמצונים כל תאים (amperometric) נמדדים בו זמנית באמצעות מגבר 200B Axopatch (התקנים מולקולריים, עם סט נמוך לעבור Bessel מסנן ב1000 הרץ להקלטה נוכחית כל תאים). לamperometry הקלטת האלקטרודה סיבי פחמן מחובר למגבר שני (Axopatch 200B) וממוקמת בסמוך לממברנת הפלזמה ונערכה ב700 mV. הזרמים כל התא וחמצונים (amperometric) ניתן להקליט ויחסים נוכחי מתח יכולים להיות שנוצרו באמצעות פרוטוקול צעד מתח. בניגוד לכיול amperometric הרגיל, שדורש המרה לריכוז, הנוכחי הוא דיווח ישירות ללא התחשבות בנפח 7 היעילים. לפיכך, את הנתונים המתקבלמייצג גבול תחתון לזרימת דופאמין כי חלק המשדר הפסיד לפתרון התפזורת.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתח מהדק וamperometry סימולטני מציעים את היתרונות הבאים. כל סוגי התאים נגישים וניתן להשתמש בו להקלטה. זיהוי של תאים או נוירונים בי את ההקלטות נעשות הוא פשוט וברור. בפרט, אם התא מסומן fluorescently ידי הוספת תג ניאון לחלבון של עניין הנסיין יכול לבחור בקלות לתא המטרה או תא העצב. התצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר Sanika Chirwa לסקירה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (DA026947, DA021471, וNS071122).
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
