Eşzamanlı Gerilim-kelepçe ve Amperometri ile Dopamin Film Tek Hücre Ölçümü
Summary
Amperometrik tekniği spontan dopamin oksitlenmeye tarafından üretilen oksidatif akımı algılayarak tek bir hücreden dopamin salınımını ölçer. Eşzamanlı gerilim kelepçe ve amperometri metodolojisi dopamin taşıyıcısı ve dopamin ters taşıma Bu faaliyetin düzenleyici rolünün genel "faaliyet" arasındaki mekanistik ilişki bulunmaktadır.
Abstract
Sinaptik aralıkta dopamin içine yayımlanmasından sonra onun öncesi ve post-sinaptik hedeflere 1 yoluyla biyolojik özelliklerini uygular. Dopamin sinyali difüzyon 2-3, ekstraselüler enzimler 4, ve membran taşıyıcıları 5 ile sonlandırılır. Dopamin nöronlarının peri-sinaptik aralıkta bulunan dopamin taşıyıcısı, bir içe dopamin akı (uptake) aracılığıyla serbest aminler temizler. Dopamin taşıyıcısı da dışa aktarım veya dopamin 5 efflux denilen bir süreçle içeriden dışarıya aminler serbest ters yönde çalışabilir. . Ileri (uptake) ve ters (effluks) 5: daha 20 yıl önce Sulzer ark dopamin taşıyıcısı iki faaliyet modlarında çalışabilir bildirdi. Taşıyıcı aracılığıyla akış üzerinden serbest nörotransmitter olan hücre dışı alanı için dopamin büyük bir miktarı hareket edebilir, ve hücre dışı dopamin saat içinde önemli düzenleyici bir rol oynadığı görülmüştüromeostasis 6. Burada simultane yama kelepçe ve amperometri kayıt membran potansiyeli denetlenir milisaniyelik zaman çözünürlüğü ile effluks mekanizması yoluyla serbest dopamin ölçmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Bunun için, tüm-hücre akım ve oksidatif (amperometrik) sinyalleri bir Axopatch 200B amplifikatör (Moleküler Cihazlar, tam hücreli geçerli kayıt için 1.000 Hz bir alçak geçiren Bessel filtre seti ile) kullanılarak eş zamanlı olarak ölçülür. Bir karbon fiber elektrot kayıt amperometri, ikinci bir amplifikatör (Axopatch 200B) bağlı olan ve plazma zarına bitişik yerleştirilen ve +700 mV tutulur için. Tüm-hücre ve oksidatif (amperometrik) akımları kaydedilebilir ve akım-voltaj ilişkisi bir voltaj adımı protokol kullanılarak oluşturulabilir. Konsantrasyon ile dönüştürülmesini gerektirir olağan amperometrik kalibrasyon aksine, mevcut etkin hacmi 7 dikkate alınmadan hemen rapor edilir. Bu nedenle, sonuçta elde edilen verilerBazı verici toplu çözüm için kaybolur, çünkü dopamin efflux bir alt limit temsil eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eşzamanlı voltaj-klemp ve amperometri aşağıdaki faydaları vardır. Tüm hücre tipleri tarafından erişilebilir ve kayıt için kullanılabilir. Kayıtları yapılır hücreleri veya nöronun tespiti basit ve anlaşılırdır. Hücre floresan ilgili proteini ile bir floresan etiket ekleyerek işaretli olarak, özellikle deneyi kolaylıkla hedef hücre ya da nöron seçebilir. Konfigürasyonu deneysel yama pipet yoluyla, veya banyo solüsyonu 10, bu ajanların ilave edilerek ya da farmakolojik ajanlar i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu elyazmasının eleştirel yaklaşım Dr Sanika Chirwa ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (DA026947, DA021471 ve NS071122) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
