Single Cell Messung der Freisetzung von Dopamin mit gleichzeitiger Voltage-Clamp-und Amperometry
Summary
Der amperometrische Technik misst Dopamin-Freisetzung aus einer einzelnen Zelle durch Detektieren der aktuellen durch spontane oxidative Dopamin Oxidation produziert. Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie Methodik zeigen die mechanistische Beziehung zwischen der Gesamt-Wertung "Aktivität" Dopamin-Transporter und die regulatorische Rolle dieser Aktivität auf den Rücktransport von Dopamin.
Abstract
Nach seiner Freilassung in den synaptischen Spalt, Dopamin übt seine biologischen Eigenschaften über seine Pre-und Post-synaptischen Ziele 1. Die Dopamin-Signal wird durch Diffusion 2-3, extrazelluläre Enzyme 4 und Membrantransportern 5 beendet. Die Dopamin-Transporter in der peri-synaptischen Spalt von Dopamin-Neuronen angeordnet löscht die freigesetzten Amine durch eine nach innen Dopamin Flusses (Uptake). Die Dopamin-Transporter kann auch in umgekehrter Richtung arbeiten, um Amine von innen nach außen freigeben in einem Prozess namens Abtransport oder Efflux von Dopamin 5. . Mehr als 20 Jahren Sulzer et al berichtete die Dopamin-Transporter kann in zwei Modi der Tätigkeit zu betreiben: forward (Aufnahme) und rückwärts (Efflux) 5. Der Neurotransmitter über Efflux durch den Transporteur freigesetzt werden eine große Menge an Dopamin in den extrazellulären Raum bewegen, und hat gezeigt, dass eine große regulatorische Rolle der extrazellulären Dopamin h spielenomeostasis 6. Hier beschreiben wir, wie die gleichzeitige Patch-Clamp-und Amperometrie Aufzeichnung verwendet werden, um veröffentlicht Dopamin über den Effluxmechanismen mit Millisekunden Zeitauflösung, wenn das Membranpotential gesteuert wird messen. Hierzu werden Ganzzell-Strom und oxidative (amperometrisch) Signale gleichzeitig unter Verwendung eines Axopatch 200B Verstärkers (Molecular Devices, mit einer Tiefpaß-Bessel-Filter Satz bei 1000 Hz für Ganzzell-Strom-Aufzeichnung) gemessen. Für Amperometrie Aufzeichnen eines Kohlenstofffaser-Elektrode ist mit einem zweiten Verstärker (Axopatch 200B) verbunden ist und angrenzend und in die Plasmamembran bei +700 mV gehalten. Die Ganzzell-und oxidativen (amperometrische) Ströme können aufgezeichnet werden und die Strom-Spannungs-Beziehung kann mit Hilfe einer Spannung Schritt-Protokoll. Im Gegensatz zu der üblichen amperometrischen Kalibrierung, die Umwandlung in Konzentration erfordert, wird der Strom direkt ohne Berücksichtigung des effektiven Volumens 7 berichtet. Somit werden die resultierenden Datenstellen eine untere Grenze zu Dopamin Efflux weil einige Sender zu dem Schüttgut-Lösung verloren geht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie hat die folgenden Vorteile. Alle Zelltypen sind zugänglich und können zur Aufzeichnung verwendet werden. Die Identifizierung der Zellen oder Neuronen, wo die Aufnahmen gemacht ist einfach und unkompliziert. Insbesondere, wenn die Zelle durch Hinzufügen eines fluoreszenzmarkierten fluoreszierende Markierung auf das Protein von Interesse markiert der Experimentator kann problemlos das Zielzelle oder Neurons. Der experimentelle Aufbau ermöglicht eine gleichmäßige und kontr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Sanika Chirwa für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (DA026947, DA021471 und NS071122) unterstützt.
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
