Одноместный измерительной ячейки из высвобождение дофамина с одновременным напряжения зажим и амперометрии
Summary
Амперометрического Техника меры высвобождение дофамина из одной клетки путем определения окислительной ток, создаваемый спонтанной окисления дофамина. Одновременное зажим напряжения и амперометрии методологии выявления механистической взаимосвязи между общим «деятельность» переносчика дофамина и регулирующей роли этой деятельности на обратный транспорт дофамина.
Abstract
После его выхода в синаптическую щель, допамин оказывает своим биологическим свойствам через своих пред-и пост-синаптические цели 1. Дофамина сигнал прекращается путем диффузии 2-3, внеклеточных ферментов 4, и мембраны перевозчики 5. Переносчика дофамина, расположенных в пригородных синаптическую щель дофаминовых нейронов очищает выпустила аминов через внутренний поток дофамина (поглощение). Переносчика дофамина может работать и в обратном направлении, чтобы освободить аминов изнутри наружу в процессе, называемом внешним транспортом или истечение допамин 5. . Более 20 лет назад Sulzer и др. сообщили переносчика дофамина может работать в двух режимах деятельности: вперед (поглощение) и обратный (отток) 5. Нейромедиатора выпущен через истечение через транспортер может перемещать большое количество допамина в межклеточное пространство, и было показано, играют важную регулирующую роль в внеклеточный дофамин чomeostasis 6. Здесь мы расскажем, как одновременный зажим патч и амперометрии запись может быть использована для измерения выпущен допамина через отток механизм с временным разрешением миллисекунду, когда мембранный потенциал находится под контролем. Для этого цельноклеточной текущих и окислительного (амперометрического) сигналы измеряются одновременно, используя Axopatch 200B усилителя (Molecular Devices, с низкочастотный фильтр Бесселя набор на 1000 Гц для целой клетки текущей записи). Для амперометрии записи электрод из углеродного волокна подключен к второму усилителю (Axopatch 200B) и находится рядом с плазматической мембраной и выдерживают при +700 мВ. Целых клеток и окислительный (амперометрического) токи могут быть записаны и вольт-амперные отношения могут быть получены с использованием протокола напряжения шага. В отличие от обычных амперометрических калибровки, которая требует преобразования в концентрации, ток сообщил напрямую, без рассмотрения в силу 7 объеме. Таким образом, полученные данныепредставляют собой нижний предел дофамина истечения потому, что некоторые передатчика теряется в объеме раствора.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одновременное напряжение зажим и амперометрии имеет следующие преимущества. Все типы клеток, которые доступны и могут быть использованы для записи. Идентификация клеток или нейронов, где записи делаются просто и понятно. В частности, если ячейка флуоресцентно меченые, добавив флуорес…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Sanika Чирва для критического обзора этой рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (DA026947, DA021471, и NS071122).
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
