同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測
Summary
アンペロメトリック技術は自発的ドーパミンの酸化によって生成される酸化電流を検出することにより、単一細胞からのドーパミン放出を測定します。同時電圧クランプとアンペロメトリー方法論はドーパミントランスポーターおよびドーパミンの逆輸送上のこの活動の調節の役割の全体的な "活動"の間の機構的な関係を明らかにする。
Abstract
シナプス間隙、ドーパミンへのそのリリース後に、その前と後シナプスターゲット1を介して、その生物学的特性を発揮する。ドーパミン信号が拡散2-3、細胞外酵素4、膜輸送体5で終了します。ドーパミンニューロンの周囲のシナプス間隙に位置するドーパミントランスポーターは、内側ドーパミンフラックス（取り込み）を介して放出さアミンをクリアします。ドーパミントランスポーターはまたドーパミン5の外側への輸送または流出と呼ばれるプロセスで、内部から外部へのアミンを解放するために逆方向に働くことができます。 。フォワード（摂取）とリバース（流出）5：20年以上前スルザーらは、ドーパミントランスポーターは、次の2つのアクティビティのモードで動作することができます報告した。トランスポーターを介して流出を介して神経伝達物質放出は、細胞外空間にドーパミンを大量に移動させることができ、細胞外ドーパミンhで主要な調節的役割を果たすことが示されているomeostasis 6。ここでは、同時パッチクランプとアンペロメトリー記録は膜電位が制御されているミリ秒の時間分解能で流出機構を介してドーパミン放出を測定するために使用する方法について説明します。このため、全細胞電流と酸化（アンペロメトリー）信号はAxopatch 200Bアンプ（Molecular Devices社、全細胞電流記録、1,000 Hzのローパスベッセルフィルタが設定された）を使用して同時に測定される。アンペロメトリーは炭素繊維電極を記録するためには、第二増幅器（Axopatch 200B）に接続されており、細胞膜に隣接して配置され、700 mVに保持されます。全細胞と酸化（アンペロメトリー）電流を記録することができ、電流 – 電圧の関係は、電圧ステッププロトコルを使用して生成することができます。濃度への変換を必要とする通常のアンペロメトリックキャリブレーションとは異なり、現在は有効容積7を考慮せずに直接報告されています。従って、得られたデータいくつかの送信機はバルク溶液に失われるので、ドーパミン流出には下限を表しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
同時に電圧クランプとアンペロメトリーは、次の利点があります。すべての細胞型はアクセス可能であり、記録のために使用することができます。レコーディングが行われた細胞またはニューロンの同定は、シンプルで簡単です。特に、細胞が蛍光実験者が容易に目的の細胞や神経細胞を選択することができ、目的のタンパク質に蛍光タグを追加することで、ラベルが付いていた場合。実験?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、この原稿の重要なレビューのために博士Sanika Chirwaに感謝します。この作品は、国立衛生研究所（DA026947、DA021471、そしてNS071122）によってサポートされていました。
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
