Medição única célula de liberação de dopamina com simultânea de tensão-clamp e amperometria
Summary
A técnica amperométrica mede a libertação de dopamina a partir de uma única célula, detectando a corrente de oxidante produzido pela oxidação da dopamina espontânea. Braçadeira de tensão simultânea e metodologia amperometria revelar a relação mecanicista entre a "atividade" geral do transportador de dopamina eo papel regulador da atividade no transporte reverso da dopamina.
Abstract
Depois de sua libertação para o sináptica de dopamina fissura, exerce suas propriedades biológicas através de suas metas pré-e pós-sináptica 1. O sinal de dopamina é terminada por difusão 2-3, enzimas extracelulares 4, e transportadores de membrana 5. O transportador de dopamina, localizado na fenda peri-sináptica dos neurônios dopaminérgicos limpa as aminas liberados através de um fluxo de dopamina para dentro (captação). O transportador de dopamina pode também funcionar no sentido inverso para libertar aminas a partir de dentro para fora, num processo denominado de transporte para o exterior ou o efluxo de dopamina 5. . Mais de 20 anos atrás Sulzer et al relataram o transportador de dopamina pode funcionar em dois modos de atividade: para frente (captação) e reverso (efluxo) 5. O neurotransmissor libertado através de efluxo através do transportador pode deslocar uma grande quantidade de dopamina para o espaço extracelular, e tem sido demonstrado que desempenham um papel importante na regulação da dopamina extracelular homeostasis 6. Aqui descreve-se como patch clamp e gravação simultânea amperometria pode ser usado para medir a dopamina libertada através do mecanismo de efluxo com resolução de milissegundos do tempo em que o potencial de membrana é controlado. Por isso, células inteiras actuais e oxidativa (amperométrico) sinais são medidos simultaneamente utilizando um amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, com um filtro passa-conjunto de filtros de Bessel de 1.000 Hz para gravação de células inteiras de corrente). Para a gravação de um amperometria eléctrodo de fibra de carbono está ligado a um segundo amplificador (Axopatch 200B), e é colocado adjacente à membrana de plasma e mantido a 700 mV. As células inteiras e oxidativa (amperométrico) as correntes podem ser registados e a relação de corrente-tensão pode ser gerado utilizando um protocolo de passo de tensão. Ao contrário da calibração habitual amperométrico, que requer a conversão de concentração, a corrente é relatado directamente sem ter em conta o volume de 7 eficaz. Assim, os dados resultantesrepresentar um limite inferior para o efluxo de dopamina porque alguns transmissor é perdido para a solução a granel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Simultânea de tensão-clamp e amperometria tem os seguintes benefícios. Todos os tipos de células são acessíveis e podem ser utilizados para a gravação. A identificação das células neuronais ou onde as gravações são feitas é simples e directa. Em particular, se a célula é marcado por fluorescência por adição de um marcador fluorescente para a proteína de interesse, o experimentador pode facilmente seleccionar a célula alvo ou neuronal. A configuração experimental permite a distribuição uniforme …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Sanika Chirwa para revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (DA026947, DA021471, e NS071122).
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
