Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen
Summary
In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid van recombinante eiwitten.
Abstract
Recombinant eiwitexpressie in bacteriën, meestal E. coli, is de meest succesvolle strategie voor milligram hoeveelheid expressie van eiwitten. Echter prokaryotische gastheren vaak minder geschikt voor expressie van humane, virale of eukaryotische eiwitten door toxiciteit van buitenlandse macromolecuul, verschillen in de eiwitvouwing machine, of door het ontbreken van bepaalde co-of post-translationele modificaties in bacteriën. Expression systemen op basis van gist (P. pastoris of S. cerevisiae) 1,2, baculovirus geïnfecteerde insecten (S. frugiperda of T. ni) cellen 3, en celvrije in vitro vertaalsystemen 2,4 zijn met succes gebruikt om de produceren zoogdiereiwitten. Intuïtief de beste overeenkomst is een warmbloedige gastheer gebruikt om de productie van recombinante eiwitten die de juiste post-translationele modificaties bevatten waarborgen. Een aantal zoogdierlijke cellijnen (humane embryonale Kidney (HEK) 293 zijn C V-1 cellen O rigin die de S V40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovarium (CHO), en anderen) succes gebruikt om milligram hoeveelheden van een aantal humane eiwitten tot overexpressie 5-9. Echter de voordelen van zoogdiercellen vaak tegen hogere kosten vereist gespecialiseerde laboratoriumapparatuur lagere eiwitopbrengsten en lange tijd om stabiele cellijnen te ontwikkelen expressie. Het verhogen van de opbrengst en de productie van eiwitten sneller, terwijl de kosten laag zijn, zijn belangrijke factoren voor veel academische en commerciële laboratoria.
We beschrijven hier een tijd-en kosten-efficiënte, tweedelige procedure voor de expressie van uitgescheiden menselijke eiwitten van vreemde HEK 293T-cellen. Dit systeem is geschikt voor het produceren microgram tot milligram hoeveelheden van functionele eiwitten voor structurele, biofysische en biochemische studies. Het eerste deel, meerdere constructen van het gen van belang te producerend in parallel en tijdelijk getransfecteerd in adherente HEK 293T-cellen in kleine schaal. De detectie en analyse van recombinant eiwit uitgescheiden in het celkweekmedium wordt door western blot analyse in de handel verkrijgbare antilichamen gericht tegen een vector gecodeerd eiwit zuivering tag. Vervolgens worden geschikt constructen voor grootschalige productie van eiwitten transient getransfecteerd met polyethyleenimine (PEI) in 10 laag celfabrieken. Eiwitten uitgescheiden in liter-volumes van geconditioneerd medium zijn geconcentreerd in hanteerbare hoeveelheden met behulp van tangentiële flow filtratie, gevolgd door zuivering door anti-HA-affiniteitschromatografie. Het nut van dit platform wordt bewezen door het vermogen om milligram hoeveelheden cytokines, cytokine receptor celoppervlakreceptoren, intrinsieke beperking factoren en virale glycoproteïnen drukken. Deze methode is ook met succes gebruikt in de bepaling van de structurele trimere ebolavirus glycoproteïne 5,10.
<p class = "jove_content"> Kortom, dit platform biedt gebruiksgemak, snelheid en schaalbaarheid terwijl het maximaliseren van eiwitten kwaliteit en functionaliteit. Bovendien is er geen extra apparatuur, andere dan een standaard bevochtigde CO 2 incubator, vereist. Deze procedure kan snel worden uitgebreid systeem van grotere complexiteit, zoals co-expressie van eiwitcomplexen, antigenen en antistoffen productie van virusachtige deeltjes voor vaccins of productie van adenovirussen of lentivirussen voor transductie van moeilijk cellijnen.Protocol
Discussion
De 10 lagen celfabrieken een effectieve vat voor de productie van milligram hoeveelheden eiwit. Een belangrijk voordeel van de cel fabriek op andere traditionele vaartuigen zoals rolflessen, schudkolven of spinner kolven, is dat niet nodig de aanschaf van extra laboratoriumapparatuur. Een standaard CO 2 incubator (~ 6,0 cu. Ft) zal gemakkelijk geschikt voor vier 10-layer cel als fabriek (afb. 2). Bovendien vereisen deze vaartuigen minder arbeid en ruimte dan schotels of rolflessen van cellen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Ontario HIV Treatment Network Research Operating Grant (ROG-G645) en Canadese Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) om JEL, en de Universiteit van Toronto beurzen naar HA, FCA, en JDC. De auteurs willen graag Marnie Fusco, Dafna Abelson en dr. Erica Ollmann Saphire danken aan het Scripps Research Institute (La Jolla, CA) voor het leveren van cellen, ebolavirus GP expressievector en algemeen advies.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
