Une plate-forme d'expression pratique et général pour la production de protéines sécrétées à partir de cellules humaines
Summary
Dans l'ère post-génomique humaine, la disponibilité de protéines recombinantes dans des conformations natives est cruciale pour la recherche structurelle, fonctionnelle et thérapeutique et le développement. Ici, nous décrivons un test et à grande échelle du système expression des protéines dans les cellules embryonnaires humaines de rein 293T qui peuvent être utilisés pour produire une variété de protéines recombinantes.
Abstract
Recombinant expression des protéines dans les bactéries, généralement E. coli, a été la stratégie la plus efficace pour l'expression quantité milligramme de protéines. Cependant, les hôtes procaryotes sont souvent pas aussi appropriée pour l'expression de l'homme, les protéines virales ou eucaryote en raison de la toxicité de la macromolécule étrangère, les différences dans le mécanisme de repliement des protéines, ou en raison de l'absence de modifications co-ou post-traductionnelle particulier chez les bactéries. Des systèmes d'expression basés sur la levure (P. pastoris ou S. cerevisiae) 1,2, infectées par le baculovirus d'insectes (S. frugiperda ou T. ni) des cellules 3 et acellulaire in vitro des systèmes de traduction 2,4 ont été utilisés avec succès pour produire des protéines de mammifères. Intuitivement, la meilleure correspondance est d'utiliser un hôte mammifère afin d'assurer la production de protéines recombinantes qui contiennent les bonnes modifications post-traductionnelles. Un certain nombre de lignées cellulaires de mammifères (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, C V-1 des cellules dans O RIGINE portant le S V40 Larget l'antigène T (COS), ovaire de hamster chinois (CHO), et d'autres) ont été utilisées avec succès pour surexprimer milligrammes d'un certain nombre de protéines humaines 5-9. Toutefois, les avantages de l'utilisation des cellules de mammifères sont souvent contrés par des coûts plus élevés, des exigences de l'équipement de laboratoire spécialisé, les rendements en protéines plus faibles et les temps longs pour développer des lignées stables de cellules d'expression. Accroître le rendement et la production des protéines plus rapide, tout en gardant des coûts bas, sont des facteurs importants pour de nombreux laboratoires universitaires et commerciaux.
Ici, nous décrivons un temps et le coût-efficace, en deux parties la procédure pour l'expression de protéines sécrétées humaines à partir de cellules HEK adhérentes 293T. Ce système est capable de produire microgramme à quelques milligrammes de protéine fonctionnelle pour des études structurales, biophysiques et biochimiques. La première partie, plusieurs constructions du gène d'intérêt sont de produired en parallèle et transfectées de façon transitoire dans des cellules HEK adhérentes 293T à petite échelle. La détection et l'analyse de la protéine recombinante sécrétée dans le milieu de culture cellulaire est réalisée par analyse western blot en utilisant des anticorps dirigés contre disponibles dans le commerce un tag vecteur protéine codée par la purification. Par la suite, des constructions appropriées pour la production de protéines à grande échelle sont transfectées de façon transitoire à l'aide polyéthylèneimine (PEI) dans les usines de cellules 10-couche. Protéines sécrétées dans les volumes litre de milieu conditionné sont concentrées en un montant gérables en utilisant une filtration à flux tangentiel, suivie d'une purification par chromatographie d'affinité anti-HA. L'utilité de cette plate-forme est prouvé par sa capacité à exprimer quelques milligrammes de cytokines, de récepteurs de cytokines, des récepteurs de surface cellulaire, des facteurs de restriction intrinsèques, et des glycoprotéines virales. Cette méthode a également été utilisé avec succès dans la détermination de la structure des trimères 5,10 glycoprotéine Ebola.
<p class = "jove_content"> En conclusion, cette plate-forme offre la facilité d'utilisation, la vitesse et l'évolutivité, tout en maximisant la qualité des protéines et la fonctionnalité. En outre, aucun matériel supplémentaire, autre qu'une norme humidifié incubateur à CO 2, est nécessaire. Cette procédure peut être rapidement étendu à des systèmes de plus grande complexité, comme la co-expression de complexes protéiques, des antigènes et des anticorps, la production de virus-like particules pour les vaccins, ou la production d'adénovirus ou des lentivirus pour la transduction de lignées cellulaires difficiles.Protocol
Discussion
Les usines cellulaires 10-couche sont un navire efficace pour la production de quelques milligrammes de protéines. Un avantage majeur de l'utilisation de l'usine cellulaire par rapport aux autres bateaux traditionnels, tels que des bouteilles, flacons roulants secouer ou spinner, c'est qu'ils ne nécessitent pas l'achat de tout équipement de laboratoire supplémentaire. Une norme incubateur à CO 2 (environ 6,0 pi ³) sera facilement accueillir quatre usines cellulaires 10-couche <strong…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un réseau de traitement du VIH de l'Ontario Subvention de fonctionnement de la recherche (GOR-G645) et les Instituts canadiens de recherche en santé Bourse de nouveau chercheur (MSH-113554) pour JEL, et l'Université de Toronto à HA bourses, CAF, et le JDC. Les auteurs tiennent à remercier Marnie Fusco, Dafna Abelson et le Dr Erica Ollmann Saphire à The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) pour les cellules fournissant, vecteur d'expression Ebola GP et des conseils généraux.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
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