פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים
Summary
בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.
Abstract
רקומביננטי ביטוי החלבון חיידקים, בדרך כלל א ' coli, הייתה האסטרטגיה המוצלחת ביותר עבור ביטוי בכמות מיליגרם של חלבונים. עם זאת, המארחים פרוקריוטים הם לעתים קרובות לא בהתאם ביטוי של חלבונים אנושיים, ויראלי או האיקריוטים בשל הרעילות של מקרומולקולה החוץ, ההבדלים מכונות קיפול חלבונים, או בשל חוסר שיתוף שינויים או שלאחר translational מסוימים של חיידקים. מערכות ההבעה על בסיס שמרים (pastoris פ או cerevisiae ס) 1,2, baculovirus-נגוע חרק (ס 'frugiperda או ט' ני) 3 תאים, תא ללא במבחנה תרגום מערכות 2,4 שימשו בהצלחה לייצר חלבונים יונקים. באופן אינטואיטיבי, את ההתאמה הטובה ביותר היא להשתמש המארח יונקים על מנת להבטיח את הייצור של חלבונים רקומביננטיים המכילים הנכון לאחר שינויים של תרגום. מספר שורות תאים יונקים (קיד עובריים אנושייםניי (HEK) 293, C-V-1 התאים O rigin הנושאים V40 S larget T-antigen (COS), השחלות אוגר סיני (CHO), ועוד) כבר נוצלו בהצלחה overexpress כמויות מיליגרם של מספר חלבונים אנושיים 5-9. עם זאת, היתרונות של שימוש בתאי יונקים הם לעתים קרובות הגיב עלויות גבוהות יותר, הדרישה של ציוד מעבדה מיוחד, תשואות נמוכות יותר חלבון, ושעות ארוכות לפתח יציבות התא קמטי הבעה. הגדלת התשואה חלבונים לייצר מהר יותר, תוך שמירה על עלויות נמוכות, הם הגורמים העיקריים למעבדות אקדמיים ומסחריים רבים.
כאן אנו מתארים זמן ועלות יעיל, חלק 2, הליך לביטוי של חלבונים המופרשים אדם חסיד תאים HEK 293T. מערכת זו הוא מסוגל לייצר מיקרוגרם כמויות מיליגרם של חלבון פונקציונלי ללימודי מבניים, biophysical ו ביוכימי. החלק הראשון, בונה רבות של הגן של עניין הם מייצרים ד במקביל transfected זמני אל חסיד תאים HEK 293T בקנה מידה קטן. זיהוי וניתוח של חלבון רקומביננטי מופרש לתוך המדיום תרבית תאים מבוצע על ידי ניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית המכוונים נגד תג וקטור המקודד טיהור חלבונים. לאחר מכן, בונה מתאים לייצור בקנה מידה גדול חלבון transfected זמני באמצעות polyethyleneimine (PEI) ב -10 מפעלים שכבת תאים. חלבונים המופרשים לתוך ליטר למוצרי כרכים של המדיום אוויר מרוכזים לתוך כמויות לניהול באמצעות סינון זרימת משיק, ואחריו טיהור ידי כרומטוגרפיה נגד HA זיקה. השירות של פלטפורמה זו היא הוכחה על ידי היכולת שלו לבטא את כמויות מיליגרם של ציטוקינים, קולטנים ציטוקינים, קולטנים בתא השטח, גורמים פנימיים, וכן הגבלה גליקופרוטאינים ויראליים. בשיטה זו השתמשו בהצלחה גם בקביעת המבנה של 5,10 גליקופרוטאין trimeric ebolavirus.
<p cילדה = "jove_content"> לסיכום, פלטפורמה זו מציעה מהירות וקלות שימוש, ויכולת הרחבה תוך מיקסום איכות החלבון ופונקציונליות. יתר על כן, הציוד ללא תוספת, למעט תקן humidified CO 2 באינקובטור, נדרשת. הליך זה עשוי להתרחב במהירות למערכות מורכבות יותר, כמו ביטוי משותף של קומפלקסים חלבונים, אנטיגנים ונוגדנים, ייצור של וירוסים כמו חלקיקים עבור חיסונים, או לייצור של adenoviruses או lentiviruses עבור התמרה של שורות תאים קשים.Protocol
Discussion
את 10-שכבת מפעלים סלולריים הם כלי יעיל לייצור כמויות מיליגרם של חלבון. היתרון הגדול של שימוש מפעל התא על כלי מסורתיים אחרים, כגון בקבוקים, צלוחיות הרים לוחצים או צלוחיות תיבת הטווח, היא שהם אינם דורשים רכישת ציוד מעבדה נוספת. תקן ה-CO 2 באינקובטור (~~~HEAD=NNS 6.0 מ"ק. מט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי HIV רשת אונטריו טיפול מחקר הפעלה גרנט (ROG-G645) וקנדה מכון פרס מחקר לחוקר הבריאות החדש (MSH-113554) כדי JEL, ואוניברסיטת טורונטו מלגות חה, FCA, וג'וינט. המחברים מבקשים להודות מארני Fusco, דפנה אבלסון וד"ר אריקה Ollmann Saphire במכון המחקר סקריפס (La Jolla, CA) עבור תאים המספקים, ebolavirus וקטור GP ביטוי וייעוץ כללי.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
