ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム
Summary
ポストヒトゲノム時代において、ネイティブコンフォメーションにおける組換えタンパク質の可用性は、構造、機能および治療の研究開発に不可欠である。ここでは、テストと組換えタンパク質のさまざまなを生成するために使用することができるヒト胚性腎臓293T細胞における大規模タンパク質発現系を記述します。
Abstract
細菌における組換えタンパク質の発現、一般的にE.大腸菌は 、蛋白質のミリグラム量の発現のための最も成功した戦略であった。しかし、原核生物宿主は、多くの人間は、ウイルスまたは真核生物の外国の高分子の毒性に起因するタンパク質、タンパク質の折り畳み機構の違い、または特定のCO-または細菌の翻訳後修飾の不足のための発現に応じてではありません。酵母（P.パストリスもしくはS.セレビシエ ）1,2、バキュロウイルス感染昆虫（S. frugiperdaまたは T NI）セル3、 および in vitro翻訳システムにおいて 、無細胞に基づく発現系は、2,4は正常にするために使用されている哺乳動物のタンパク質を生成します。直感的に、ベストマッチは、適切な翻訳後修飾を含む組換えタンパク質の生産を確保するために哺乳動物宿主を使用することです。哺乳動物細胞株の数（ヒト胚キッドネイ（HEK）S V40 larget T-抗原（COS）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）などを運ぶO riginで293、C V-1細胞）は、正常ヒトタンパク質の数ミリグラムの量を過剰発現するように利用されてきた5-9しかし、哺乳動物細胞を使用することの利点は、多くの場合、安定発現細胞株を開発するコストが高く、特殊な実験装置の要件は、低タンパク質の収量と、長い時間によって打ち消されています。コストを低く維持しながら、より高速な収率と生産するタンパク質を増加し、多くの学術的、商業的な研究所の主要な要因である。
ここでは、時間とコスト効率に優れ、接着HEK 293T細胞から分泌されるヒトタンパク質の発現のための2つの部分から成る手順を説明します。このシステムは、構造生物物理学的および生化学的研究のために機能的な蛋白質のミリグラム量にグラムを生産することが可能です。最初の部分は、目的の遺伝子の複数の構文が生成さです。並行して一時的に小さなスケールの付着HEK 293T細胞にトランスフェクションのd。細胞培養培地中に分泌された組換えタンパク質の検出および分析は、ベクトルでエンコードされたタンパク質精製タグに対する市販の抗体を用いたウェスタンブロット分析によって実行されます。その後、大規模なタンパク質の生産に適したコンストラクトを一過性に10層の細胞工場でポリエチレンイミン（PEI）を用いてトランスフェクトされる。馴化培地リットルボリュームに分泌されるタンパク質は、抗-HAアフィニティークロマトグラフィーによって精製してタンジェンシャルフローろ過を使用して、管理しやすい量に集中している。このプラットフォームのユーティリティは、サイトカイン、サイトカイン受容体、細胞表面受容体、本質的な制限要因、およびウイルスの糖蛋白質のミリグラム量を表現する能力によって証明されています。このメソッドは、成功した三量体エボラウイルス糖タンパク質5,10の構造決定で使用されています。
<p cタンパク質の品質と機能性を最大化しながら少女= "jove_contentは">結論として、このプラットフォームは、使用、速度とスケーラビリティの容易さを提供しています。また、標準加湿CO 2インキュベーター以外の追加の機器は、必要ありません。この手順は、急速にそのようなタンパク質複合体、抗原と抗体、ワクチン、または困難な細胞株の形質導入のためのアデノウイルスまたはレンチウイルスの生産のためのウイルス様粒子の生産の共発現として、より複雑なシステムに拡張することができます。Protocol
Discussion
10層の細胞の工場は、蛋白質のミリグラム量の生産のための効果的な容器です。このようなローラーボトル、振盪フラスコまたはスピナーフラスコのような他の伝統的な船、上のセルファクトリを使用する主な利点は、追加の実験装置を購入する必要がないということです。標準的なCO 2インキュベーター（〜6.0立方フィート）は、簡単に4つの10層の細胞工場（ 図2）を収…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、JEL、およびHA、FCA、とJDCのトロントフェローシップの大学にオンタリオ州のHIV治療ネットワーク研究オペレーティング·グラント（ROG-G645）と保健研究の新しい奨励賞のカナダ研究所（MSH-113554）でサポートされていました。著者らは、細胞を提供するためのスクリップス研究所（カリフォルニア州ラホーヤ）、エボラウイルスGPの発現ベクターと一般的なアドバイスでマーニーフスコ、Dafnaアベルソン博士とエリカOllmannサファイアに感謝します。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
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