En praktisk og generelle uttrykket plattform for produksjon av utskilles Proteiner fra menneskeceller
Summary
I det post-menneskelige genomikk æra, er tilgjengeligheten av rekombinante proteiner i innfødt konformasjonen avgjørende strukturelle, funksjonelle og terapeutisk forskning og utvikling. Her beskriver vi en test-og storskala protein uttrykk system i humane embryonale nyre 293T celler som kan brukes til å produsere en rekke rekombinante proteiner.
Abstract
Rekombinant protein uttrykk i bakterier, typisk E. coli, har vært den mest vellykkede strategi for milligram mengde uttrykk av proteiner. Men prokaryote vertene er ofte ikke så egnet for uttrykk av menneskelige, virale eller eukaryote proteiner grunn toksisitet av den utenlandske macromolecule, forskjeller i protein folding maskiner, eller på grunn av mangel på spesielle co-eller post-translasjonell modifikasjoner i bakterier. Expression systemer basert på gjær (P. pastoris eller S. cerevisiae) 1,2, Baculovirus-infisert insekt (S. frugiperda eller T. Ni) 3 celler, og celle-free in vitro oversettelse systemer 2,4 har blitt brukt til å produsere pattedyr proteiner. Intuitivt er det beste kamp å bruke en pattedyr vert å sikre produksjon av rekombinante proteiner som inneholder de riktige posttranslasjonelle modifikasjoner. En rekke pattedyr cellelinjer (humane embryonale KidNey (HEK) 293, har C V-1 celler i O rigin bærer S V40 larget T-antigen (COS), kinesisk hamster ovarieceller), og andre) blitt brukt til å overuttrykker milligram mengder av en rekke menneskelige proteiner 5-9. Men fordelene ved å bruke pattedyrceller ofte motvirkes av høyere kostnader, krav til spesialisert laboratorieutstyr, lavere protein avkastningsmål, og lange tider for å utvikle stabile uttrykk cellelinjer. Økende avkastning og produsere proteiner raskere, samtidig som vi holder kostnadene nede, er viktige faktorer for mange akademiske og kommersielle laboratorier.
Her beskriver vi en tid-og kost-effektiv, todelte prosedyre for uttrykket av utskilt menneskelige proteiner fra heftende hek 293T celler. Dette systemet er i stand til å produsere mikrogram til milligram mengder funksjonell protein for strukturelle, biofysiske og biokjemiske studier. Den første delen, flere konstruksjoner av genet av interesse er produsererd parallelt og forbigående tilført inn heftende hek 293T celler i liten skala. Påvisning og analyse av rekombinant protein skilles ut i cellekultur medium er utført ved Western blot analyse ved hjelp av kommersielt tilgjengelige antistoffer rettet mot en vektor-kodet proteinrensing tag. Deretter er egnede konstruksjoner for storskala protein produksjon forbigående tilført hjelp Polyethyleneimine (PEI) i 10-lags cellefabrikker. Proteiner utskilt inn liter volumer med aircondition medium er konsentrert i håndterbare mengder ved hjelp tangential flyt filtrering, etterfulgt av rensing ved anti-HA affinitet kromatografi. Nytten av denne plattformen er bevist av dens evne til å uttrykke milligram mengder av cytokiner, cytokin reseptorer, reseptorer på celleoverflaten, iboende restriksjoner faktorer, og viral glykoproteiner. Denne metoden ble også brukt med hell i det strukturelle fastsettelse av trimeric ebolavirus glykoprotein 5,10.
<p cLass = "jove_content"> Som konklusjon, tilbyr denne plattformen brukervennlighet, hastighet og skalerbarhet samtidig maksimere protein kvalitet og funksjonalitet. Dessuten er det ikke ekstra utstyr, annet enn en standard fuktet CO 2 inkubator, som kreves. Denne prosedyren kan raskt utvides til systemer av større kompleksitet, som co-uttrykk for protein komplekser, antigener og antistoffer, produksjon av viruslignende partikler for vaksiner, eller produksjon av adenoviruses eller lentiviruses for transduksjon av vanskelige cellelinjer.Protocol
Discussion
De 10-lags cellefabrikker er en effektiv fartøy for produksjon av milligram mengder protein. En stor fordel med å bruke cellen fabrikken over andre tradisjonelle fartøyer, for eksempel roller flasker, rist kolber eller sluk flakonger, er at de ikke krever kjøp av ytterligere laboratorieutstyr. En standard CO 2 inkubator (~~~HEAD=NNS 6.0 cu. Ft) vil lett plass til fire 10-lags cellefabrikker (Fig. 2). I tillegg har disse fartøyene krever mindre arbeid og plass enn retter, flakonger eller …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en Ontario HIV Behandling Network Forskning driftstilskudd (ROG-G645) og Canadian Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) til JEL, og University of Toronto Fellowships til HA, FCA, og JDC. Forfatterne ønsker å takke Marnie Fusco, Dafna Abelson og Dr. Erica Ollmann Saphire ved The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) for å gi celler, ebolavirus GP uttrykk vektor og generelle råd.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
