Wholemount Immunhistochemie für die Aufdeckung von komplexen Gehirn Topographie

Summary

Neuronale Schaltkreise sind topographisch in Funktionsräume mit spezifischen molekularen Profile organisiert. Hier bieten wir Ihnen die praktischen und technischen Schritte zur Aufdeckung globale Gehirn Topographie mit einem vielseitigen wholemount immunhistochemische Färbung Ansatz. Wir demonstrieren den Nutzen der Methode mit dem wohlverstandenen Zytoarchitektur und Schaltung des Kleinhirns.

Abstract

Die wiederholte und gut verstanden zelluläre Architektur des Kleinhirns machen es ein ideales Modellsystem für die Erkundung des Gehirns Topographie. Underlying ihrer relativ einheitlichen Zytoarchitektur ist eine komplexe Anordnung von parasagittale Bereichen Gen-und Proteinexpression. Die molekulare Kompartimentierung des Kleinhirns wird durch die anatomische und funktionelle Organisation der afferenten Fasern gespiegelt. Um volles Verständnis für die Komplexität der Kleinhirn-Organisation, die wir zuvor eine wholemount Färbung Ansatz für die Hochdurchsatz-Analyse von Mustern Defekte im Kleinhirn der Maus verfeinert. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Reagenzien, Instrumente und praktische Schritte, die nützlich, um erfolgreich zu enthüllen Proteinexpressionsmuster in der adulten Maus Kleinhirn mit wholemount Immunfärbung sind. Die Schritte hier hervorgehoben zeigen die Nützlichkeit dieser Methode die Expression von zebrinII / aldolaseC als Beispiel, wie die feinen Topographie des Gehirns in seiner offenbarennativen dreidimensionalen Konformation. Ebenfalls beschrieben werden Anpassungen an das Protokoll, das für die Visualisierung der Proteinexpression in afferenten Vorsprünge und große Kleinhirn für vergleichende Untersuchungen der molekularen Topographie zu ermöglichen. Um diese Anwendungen zu veranschaulichen, werden Daten aus afferenten Färbung des Rattenkleinhirn enthalten.

Protocol

1. Tierische Perfusion und Kleinhirn Dissection Je nach Protein kann Perfusion für erfolgreiches Färbung 1,2. Transcardiac Perfusion ist eine invasive, nicht-Überleben Prozedur, die die ordnungsgemäße Verwendung der Anästhesie erfordert. Korrekte Ausbildung, institutionelle Zulassung und Genehmigung IACUC sind alle notwendig, bevor Sie den Vorgang. Es ist immer eine gute Idee, um der Institution Tierärzte wenden, um Hilfe bei der Identifizierung und den Erwerb von experimentellen Anforderung…

Discussion

Wir haben die technischen Details für eine erfolgreiche wholemount Färbung mit einem vielseitigen Ansatz für immunhistochemische aufschlussreich Protein-Expression im sich entwickelnden und adulten Gehirn benötigt beschrieben. Durch diesen Ansatz lassen sich komplexe molekulare Expressionsmuster analysiert und Gehirn Topographie, ohne dass umständlich und zeitaufwendig Gewebe Schnitte Verfahren geschätzt.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die gemusterte Expression verschiedener Prot…

Materials

Materials	Function in protocol
Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2)	Allows for consistent and slow perfusion.
Sharp-tip Scissors (FST/14081-08)	General use in perfusion and dissection.
Blunt-tip Forceps (FST/91100-12)	To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle.
Forceps (FST by Dumont AA/11210-10)	For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection.
Nutator (Fisher Scientific)	Used to keep tissue in motion during incubation periods.
1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube)	All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion.
Perforated spoon (FST/10370-17)	Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution.
Leica MZ16 FA microscope	Used to examine wholemount staining.
Leica DFC3000 FX camera	Used to capture wholemount images.

Table 1.

Example calendar for a typical wholemount experiment
Day 1	Dent’s fix, room temperature, 8 hrs				Dent’s bleach, 4°C, overnight
Day 2	100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each			100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min			100% MeOH, -80°C, overnight
Day 3	50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min	15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min		100% PBS, room temperature, 60-90 min		10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min	100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each	PMT, 4°C, overnight
Day 4-5	PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs
Day 6	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each			PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex)
Day 7	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each		PBT, room temperature, 2 hrs			Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized

Table 2.

Recipes (*=prepare fresh every time)
PBS (phosphate buffered saline)	0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417)
PFA (Paraformaldehyde)	Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353)
Dent’s Fixative3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4)
Dent’s Bleach3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide
Enzymatic Digestion	10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS.
PBST	PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.)
PMT25*	PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
PBT25*	PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
DAB*	Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction).
ABC Complex Solution	Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000)

Table 3.