Immunoistochimica Wholemount per rivelare Topografia Cervello Complex

Summary

Circuiti neurali sono topograficamente organizzate in compartimenti funzionali con specifici profili molecolari. Qui, forniamo i passi pratici e tecnici per rivelare la topografia globale del cervello utilizzando un approccio versatile wholemount colorazione immunoistochimica. Abbiamo dimostrato l'utilità del metodo che utilizza il ben capito citoarchitettura e circuiti del cervelletto.

Abstract

L'architettura ripetuto e ben compreso cellulare del cervelletto ne fanno un sistema modello ideale per esplorare la topografia del cervello. Alla base della sua citoarchitettura relativamente uniforme è una complessa serie di domini parasagittali del gene e l'espressione delle proteine. La compartimentazione molecolare del cervelletto si riflette l'organizzazione anatomica e funzionale delle fibre afferenti. Per apprezzare pienamente la complessità di organizzazione cerebellare in precedenza abbiamo affinato un approccio wholemount colorazione ad alto rendimento per l'analisi dei difetti di patterning nel cervelletto mouse. Questo protocollo descrive in dettaglio i reagenti, strumenti e misure pratiche che sono utili per rivelare con successo pattern di espressione delle proteine ​​nel cervelletto topo adulto utilizzando immunostaining wholemount. I passaggi qui evidenziati dimostrare l'utilità di questo metodo utilizza l'espressione di zebrinII / aldolaseC come esempio di come la topografia sottile del cervello può essere rivelato nel suonativo conformazione tridimensionale. Anche descritto sono adattamenti al protocollo che permettono la visualizzazione di espressione della proteina in proiezioni afferenti e cervelletti grande per gli studi comparativi di topografia molecolare. Per illustrare queste applicazioni, i dati di colorazione afferente del cervelletto di ratto sono inclusi.

Protocol

1. Animal perfusione e dissezione Cervelletto A seconda della proteina, perfusione può essere essenziale per 1,2 colorazione successo. Perfusione transcardiaca è invasivo, non la sopravvivenza procedura che richiede il corretto uso di anestetici. Corretta formazione, approvazione istituzionale, e l'approvazione IACUC sono tutte necessarie prima di tentare la procedura. E 'sempre una buona idea di consultare i veterinari dell'ente per ottenere aiuto per identificare i requisiti sperime…

Discussion

Abbiamo descritto i dettagli tecnici necessari per la colorazione wholemount successo con un approccio versatile immunoistochimica per l'espressione delle proteine ​​rivelatrici nel cervello in via di sviluppo e adulti. Usando questo approccio, complessi schemi di espressione molecolari possono essere analizzati e topografia cervello apprezzato senza la necessità di procedure tessuti laboriose e richiedono tempo sezionamento.

Questo protocollo è stato usato per rivelare l'espre…

Materials

Materials	Function in protocol
Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2)	Allows for consistent and slow perfusion.
Sharp-tip Scissors (FST/14081-08)	General use in perfusion and dissection.
Blunt-tip Forceps (FST/91100-12)	To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle.
Forceps (FST by Dumont AA/11210-10)	For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection.
Nutator (Fisher Scientific)	Used to keep tissue in motion during incubation periods.
1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube)	All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion.
Perforated spoon (FST/10370-17)	Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution.
Leica MZ16 FA microscope	Used to examine wholemount staining.
Leica DFC3000 FX camera	Used to capture wholemount images.

Table 1.

Example calendar for a typical wholemount experiment
Day 1	Dent’s fix, room temperature, 8 hrs				Dent’s bleach, 4°C, overnight
Day 2	100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each			100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min			100% MeOH, -80°C, overnight
Day 3	50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min	15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min		100% PBS, room temperature, 60-90 min		10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min	100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each	PMT, 4°C, overnight
Day 4-5	PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs
Day 6	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each			PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex)
Day 7	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each		PBT, room temperature, 2 hrs			Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized

Table 2.

Recipes (*=prepare fresh every time)
PBS (phosphate buffered saline)	0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417)
PFA (Paraformaldehyde)	Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353)
Dent’s Fixative3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4)
Dent’s Bleach3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide
Enzymatic Digestion	10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS.
PBST	PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.)
PMT25*	PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
PBT25*	PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
DAB*	Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction).
ABC Complex Solution	Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000)

Table 3.