La inmunohistoquímica wholemount de Topografía Revelando Complex Brain

Summary

Circuitos neuronales están topográficamente organizadas en compartimentos funcionales con determinados perfiles moleculares. Aquí, ofrecemos los pasos prácticos y técnicos para revelar la topografía global del cerebro mediante un método versátil wholemount tinción inmunohistoquímica. Se demuestra la utilidad del método que utiliza la citoarquitectura bien entendida y la circuitería de cerebelo.

Abstract

La arquitectura repetida y bien entendido-celular del cerebelo lo convierten en un sistema modelo ideal para explorar la topografía cerebral. Detrás de su citoarquitectura relativamente uniforme es un complejo conjunto de dominios parasagitales de expresión génica y proteica. La compartimentación molecular del cerebelo se refleja en la organización anatómica y funcional de las fibras aferentes. Para apreciar plenamente la complejidad de la organización del cerebelo que previamente refinado un enfoque tinción wholemount de análisis de alto rendimiento de los defectos de modelado en el cerebelo de ratón. Este protocolo se describe en detalle los reactivos, instrumentos y medidas prácticas que son útiles para revelar los patrones de éxito de expresión de proteínas en el cerebelo de ratones adultos mediante el uso de inmunotinción wholemount. Los pasos resaltada aquí demuestran la utilidad de este método que utiliza la expresión de zebrinII / aldolaseC como un ejemplo de cómo la topografía fino del cerebro puede ser revelada en sunativo conformación tridimensional. También se describen las adaptaciones del protocolo que permite la visualización de expresión de la proteína en las proyecciones aferentes y cerebelo, sin limitación para los estudios comparativos de la topografía molecular. Para ilustrar estas aplicaciones, los datos de tinción aferente del cerebelo de rata están incluidos.

Protocol

1. Los animales fueron perfundidos y disección Cerebelo Dependiendo de la proteína, la perfusión puede ser esencial para el 1,2 tinción con éxito. La perfusión transcardiaca es una técnica invasiva, no la supervivencia de procedimiento que requiere el uso apropiado de anestésicos. Formación adecuada, la aprobación institucional, y la aprobación del IACUC son necesarios antes de intentar el procedimiento. Siempre es una buena idea consultar a los veterinarios de la institución para obten…

Discussion

Hemos descrito los detalles técnicos necesarios para la tinción wholemount éxito utilizando un enfoque de inmunohistoquímica versátil para la expresión de la proteína revelador en el desarrollo del cerebro y de adultos. Mediante el uso de este enfoque, los patrones de expresión complejos moleculares pueden ser analizados y la topografía del cerebro apreciado sin la necesidad de laborioso y procedimientos que consumen tejidos de seccionamiento.

Este protocolo se ha utilizado para rev…

Materials

Materials	Function in protocol
Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2)	Allows for consistent and slow perfusion.
Sharp-tip Scissors (FST/14081-08)	General use in perfusion and dissection.
Blunt-tip Forceps (FST/91100-12)	To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle.
Forceps (FST by Dumont AA/11210-10)	For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection.
Nutator (Fisher Scientific)	Used to keep tissue in motion during incubation periods.
1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube)	All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion.
Perforated spoon (FST/10370-17)	Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution.
Leica MZ16 FA microscope	Used to examine wholemount staining.
Leica DFC3000 FX camera	Used to capture wholemount images.

Table 1.

Example calendar for a typical wholemount experiment
Day 1	Dent’s fix, room temperature, 8 hrs				Dent’s bleach, 4°C, overnight
Day 2	100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each			100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min			100% MeOH, -80°C, overnight
Day 3	50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min	15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min		100% PBS, room temperature, 60-90 min		10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min	100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each	PMT, 4°C, overnight
Day 4-5	PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs
Day 6	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each			PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex)
Day 7	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each		PBT, room temperature, 2 hrs			Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized

Table 2.

Recipes (*=prepare fresh every time)
PBS (phosphate buffered saline)	0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417)
PFA (Paraformaldehyde)	Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353)
Dent’s Fixative3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4)
Dent’s Bleach3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide
Enzymatic Digestion	10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS.
PBST	PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.)
PMT25*	PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
PBT25*	PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
DAB*	Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction).
ABC Complex Solution	Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000)

Table 3.