खुलासा परिसर मस्तिष्क टोपोग्राफी के लिए wholemount immunohistochemistry

Summary

तंत्रिका सर्किट भौगोलिक विवरण के अनुसार विशिष्ट आणविक प्रोफाइल के साथ कार्यात्मक डिब्बों में आयोजित कर रहे हैं. यहाँ, हम वैश्विक मस्तिष्क है बहुमुखी wholemount immunohistochemical धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग कर स्थलाकृति खुलासा करने के लिए व्यावहारिक और तकनीकी कदम प्रदान करते हैं. हम अच्छी तरह से समझ cytoarchitecture और सेरिबैलम के circuitry पद्धति का उपयोग करके की उपयोगिता प्रदर्शित करता है.

Abstract

सेरिबैलम दोहराया और अच्छी तरह से समझ सेलुलर वास्तुकला यह मस्तिष्क स्थलाकृति की खोज के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाने. इसके अपेक्षाकृत वर्दी cytoarchitecture के अंतर्निहित जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति की parasagittal डोमेन की एक जटिल सरणी है. सेरिबैलम की आणविक compartmentalization अभिवाही फाइबर के संरचनात्मक और कार्यात्मक संगठन द्वारा नजर आता है. को पूरी तरह से अनुमस्तिष्क संगठन की जटिलता की सराहना करते हैं हम पहले माउस सेरिबैलम में patterning के दोष के उच्च throughput विश्लेषण के लिए एक wholemount धुंधला दृष्टिकोण परिष्कृत. इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन अभिकर्मकों, उपकरण, और व्यावहारिक कदम है कि सफलतापूर्वक वयस्क माउस सेरिबैलम में wholemount Immunostaining का उपयोग करके प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न पता चलता है के लिए उपयोगी होते हैं. चरणों पर प्रकाश डाला यहाँ कैसे मस्तिष्क के ठीक स्थलाकृति में अपनी प्रगट किया जा सकता का एक उदाहरण के रूप में zebrinII / aldolaseC की अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए इस पद्धति की उपयोगिता का प्रदर्शनदेशी रचना तीन आयामी. इसके अलावा वर्णित प्रोटोकॉल है कि अभिवाही आणविक स्थलाकृति के तुलनात्मक अध्ययन के लिए और बड़े मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है अनुमानों में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए रूपांतरों हैं. इन आवेदनों का वर्णन करने के लिए, चूहा सेरिबैलम के अभिवाही धुंधला से डेटा शामिल हैं.

Protocol

1. पशु परफ्यूज़न और सेरिबैलम विच्छेदन प्रोटीन पर निर्भर करता है, छिड़काव के सफल धुंधला 1,2 के लिए आवश्यक हो सकता है. Transcardiac छिड़काव एक आक्रामक, गैर अस्तित्व प्रक्रिया है कि anesthetics के समुचित उपयोग की आव?…

Discussion

हम तकनीकी सफल wholemount विकासशील और वयस्क मस्तिष्क में खुलासा प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक बहुमुखी immunohistochemical दृष्टिकोण का उपयोग कर धुंधला के लिए आवश्यक जानकारी का वर्णन किया है. इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, जट…

Materials

Materials	Function in protocol
Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2)	Allows for consistent and slow perfusion.
Sharp-tip Scissors (FST/14081-08)	General use in perfusion and dissection.
Blunt-tip Forceps (FST/91100-12)	To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle.
Forceps (FST by Dumont AA/11210-10)	For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection.
Nutator (Fisher Scientific)	Used to keep tissue in motion during incubation periods.
1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube)	All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion.
Perforated spoon (FST/10370-17)	Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution.
Leica MZ16 FA microscope	Used to examine wholemount staining.
Leica DFC3000 FX camera	Used to capture wholemount images.

Table 1.

Example calendar for a typical wholemount experiment
Day 1	Dent’s fix, room temperature, 8 hrs				Dent’s bleach, 4°C, overnight
Day 2	100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each			100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min			100% MeOH, -80°C, overnight
Day 3	50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min	15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min		100% PBS, room temperature, 60-90 min		10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min	100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each	PMT, 4°C, overnight
Day 4-5	PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs
Day 6	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each			PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex)
Day 7	PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each		PBT, room temperature, 2 hrs			Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized

Table 2.

Recipes (*=prepare fresh every time)
PBS (phosphate buffered saline)	0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417)
PFA (Paraformaldehyde)	Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353)
Dent’s Fixative3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4)
Dent’s Bleach3*	4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide
Enzymatic Digestion	10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS.
PBST	PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.)
PMT25*	PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
PBT25*	PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
DAB*	Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction).
ABC Complex Solution	Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000)

Table 3.