متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا
Summary
ويرد بروتوكول spectrofluorometric لقياس نفاذية افتتاح الميتوكوندريا المسام الانتقال في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا هنا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من الكالسيوم الميتوكوندريا<sup> 2 +</sup> المناولة وحجم الميتوكوندريا الغشاء المحتملة والميتوكوندريا. وكما وصفت إجراءات الحصول على قلب عالية الجودة والوظيفية الميتوكوندريا.
Abstract
الانتقال نفاذية المسام الميتوكوندريا (mtPTP) هي قناة غير محددة التي تشكل غشاء الميتوكوندريا في الداخلية لنقل المواد المذابة مع الكتلة الجزيئية أصغر من 1.5 كيلو دالتون. على الرغم من أن هوية نهائية الجزيئي للمسام لا تزال قيد المناقشة، والبروتينات مثل D cyclophilin، وVDAC ANT تسهم في تشكيل mtPTP. بينما راسخة إشراك افتتاح mtPTP في موت الخلايا 1، تتراكم الأدلة تشير إلى أن mtPTP يخدم دورا الفسيولوجية خلال كا 2 + التوازن الميتوكوندريا 2، والطاقة الحيوية الأكسدة يشير 3.
يتم تشغيل mtPTP الافتتاح كا 2 + مصفوفة ولكن يمكن أن يكون نشاطها عن طريق التضمين عدة عوامل أخرى مثل الإجهاد التأكسدي، ونضوب النوكليوتيدات الأدينين، تركيزات عالية من بي، الميتوكوندريا أو إزالة الاستقطاب الغشاء uncoupling، والأحماض الدهنية طويلة السلسلة 4. في المختبر، mtPTP يمكن أن يكون افتتاح منظمة العمل ضد الجوعieved عن طريق زيادة تركيز الكالسيوم + 2 داخل المصفوفة الميتوكوندريا من خلال إضافات خارجية من الكالسيوم 2 + (القدرة على الاحتفاظ الكالسيوم). عندما كا 2 + المستويات داخل الميتوكوندريا التوصل إلى عتبة معينة، ويفتح mtPTP ويسهل كا 2 + الإصدار، تبديد للبروتون القوة الدافعة، وانهيار غشاء المحتملة وزيادة في حجم مصفوفة الميتوكوندريا (تورم) الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تمزق الميتوكوندريا الغشاء الخارجي وفقدان لا رجعة فيها وظيفة العضيم.
نحن هنا وصف فحص فلوروميتريك التي تسمح لتوصيف شامل لافتتاح mtPTP في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من 3 معلمات الميتوكوندريا التي يتم تعديلها عند افتتاح mtPTP يحدث: الميتوكوندريا كا التعامل مع + 2 (امتصاص وإطلاق، مقاسا كا 2 + تركيز على المدى المتوسط الفحص)، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا، وmitochondrial الحجم. الأصباغ المستخدمة لقياس الكالسيوم 2 + على المدى المتوسط وفحص غشاء الميتوكوندريا المحتملة هي FURA FF، وهي impermeant الغشاء، الذي يخضع لمؤشر ratiometric تحولا في الطول الموجي الإثارة في حضور كا 2 +، وJC-1، وهي الموجبة، ratiometric المؤشر الذي يشكل مونومرات الأخضر أو الأحمر في المجاميع المحتملة غشاء المنخفضة والعالية، على التوالي. يتم قياس التغيرات في حجم الميتوكوندريا عن طريق تسجيل تشتت الضوء من التعليق الميتوكوندريا. منذ مطلوبة عالية الجودة، الميتوكوندريا وظيفية للمقايسة افتتاح mtPTP، وصفنا أيضا الخطوات اللازمة للحصول على حالها، إلى جانب القلب معزولة للغاية وظيفية الميتوكوندريا.
Protocol
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا يصف الخطوات اللازمة لتقييم التجريبية افتتاح نفاذية المسام الانتقال في قلب معزولة الميتوكوندريا (الشكل 1 والشكل 4): إجراءات عزل الميتوكوندريا قلب الفأر، والضوابط التي تضمن سلامة الجهاز التنفسي وظيفة، المعلمات الميتوكوندريا خلال رصد mtP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل HL094536 (BJH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O’Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP – Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
